小中大【分享】植物细胞原生质体制制备与融合
植物细胞原生质体制制备与融合
1、原生质体
常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2
新的手段冲破自然界的禁钢。1937年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。196O年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。
植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
2、原生质体制备
(1)取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2～3次，然后浸人 70%酒精消毒后，再放进 3%次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
(2)酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种PH值在5·5～5·8的缓冲液，内合纤维素酶0.3%～3.0%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
(3) 分离
在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取200～400目的不锈钢网或尼龙布j叭i过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。
(4) 洗涤
刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2～4次。
(5) 鉴定
只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。
4、 原生质体的融合
(1)化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇(PEG)纳合成钙高pH诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法(在无菌条件下进行)：
按比例混合双亲原生质体-----滴加 PEG溶液，摇匀，静置----滴加高钙高pH值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。
(2)物理法诱导融合 1979年Senda等发明了微电极法诱导细胞融合。1981年Zi。。mann等提出了改进的平行电极法，现简介如下：
将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。
上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以X射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移;致死量处理后合u可能产生没再仅体万染色体w划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。
经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型.
2) 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。
3) 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。
4) 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。
④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。
5、 杂合体的鉴别与筛选
双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养(液体或固体)，再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。
(1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：
若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞;若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞;如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志;发现h述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。
(2)以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。
遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。
白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBxAh，可互补为绿色细胞株AaBb。
生长互补：甲细胞株缺外源激素A不能生长，乙细胞株需要提供外源激素B才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素A、B的选择培养基上可能生长。
抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性(如抗卡那霉素)，则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。
代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。
(3)采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP，见8.2.2.2)和随机扩增多态性
DNA(RAPD)分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。
(4)根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。
