[分享帖]实验日记

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• bongte (2012-4-29 13:17:58)

  昨天学校的网络出了问题，一直上不了网，害得我昨天没有写成日记，就今天一起补上好了。
  昨天和今天一共复苏了四种细胞：Raji、Molt4、HL60和HL60/ADM。复苏步骤如下：
  1.把细胞从液氮罐中取出，迅速投入到37摄氏度的水浴箱中，震荡溶解1分钟；待溶解后，用酒精纱布擦拭冻存管，入超净台。
  2.将细胞液移入离心管中，加入5ml培养液，然后离心。800转，5分钟。
  3.弃上清，加入培养液（10%新生牛血清，90%1640），轻吹打几下，然后移入培养瓶中。复苏完毕后于显微镜下观察细胞，细胞体圆、透亮。
  4.今天再次给细胞换液。换液前，在镜下观察细胞状态，发现Raji长得不错，细胞成团生长，细胞又圆又亮。但是Molt4有1/3的细胞都死了！伤心！不过，剩下的2/3状态还好，应该再养一养就长得好了。HL60和HL60/ADM状态尚可，但都有小部分死细胞。这应该是细胞在复苏之后的正常现象，因为DMSO的细胞毒性作用；要不然就是细胞在冻存的时候其状态就不好。
  5.将细胞离心（800转，5分钟）后，去上清，加入新的培养基，轻轻吹打几次，移入培养瓶中。
  6.这一周计划把细胞养好，并设计实验方案，为下周的CCK-8实验做准备。

• bongte (2012-4-29 13:18:29)

  那支离心管里的培养基在培养了48小时后，仍然是清亮的，未见悬浮物或絮状物。所以不是我的操作失误造成了污染。然后和师兄讨论后才发现，原来是师兄把那瓶1640中加入了血清，配成了全培，又没有告诉我。害我以为那是没加血清的1640，又在里面加了血清。使培养基的血清浓度升高，使培养基的PH值降低，细胞不能耐受，所以那天我换了液的细胞全死了。所以应该是这个原因害死了我的细胞。但为什么U937没事，这个我就不清楚了。从这件事，我知道了，试剂一定要用自己的！！（我自己的1640用完了，那家公司又老是送不来，所以就用的师兄的）如果要用别人的，在用之前一定要问清楚有没有加什么东西。

• bongte (2012-4-29 13:19:15)

  最近真的不知道学校的网络在想什么，老是出故障，完全上不了网。跑去问了网络中心的人，说是在维修，今天就可以上网了。但愿如此！
  
  今天老板叫我到中国大酒店去听讲座，是ELSEVIER主办的——Medical Statistics in Clinical Research and International Journal Publication.结果出门就堵车！广州的交通真叫人崩溃！停停走走，好不容易才到了会场，周围的人都不认识，第一次一个人出来，心里还有点小害怕(*^__^*)！不过，讲座开始之后就管不了这么多了。讲座都是说英语，我有些都听不太懂。汗！真丢脸！要加强英语呀！还好有同声传译。不过以后还是自己听懂最好！从这次讲座中，我真的学到了不少东西，要好好的把它们用起来！老板给了我这么多的机会，我要好好争气！
  
  晚上回来虽然很累了，但还是到实验室给我的宝贝细胞换液。我自己的细胞从来不让别人帮我换液。这几天我的细胞除了Raji之外，其他的Molt4、HL-60、HL60/ADM状态一直不好，特别是Molt4，基本上只有40%是活细胞，纠结！！其他的HL60这两个耐药和不耐药的细胞株也不好，半死不活！Raji长得好，镜下观察，细胞数量较多，体积较大，圆形，折光性好，成团生长，呈葡萄状；HL60数量也很多，镜下观察细胞，发现同样是成团生长，而且团较大，我上次养过这种细胞，但细胞并不是成团，而是散在分布的，偶有细胞成小团聚集，这次为什么会出现这种情况？我考虑是因为复苏的细胞状态不好所造成的。不知道各位站友是怎样认为的。我上次养HL60/ADM时，观察到细胞是成团生长，而这次细胞却是散在的！偶尔看得到几个小细胞聚在一起，还死了一些，心痛！再养两天看看它们有没有什么变化。
  
  处理：1.把Raji吸走一半不要，再加入新鲜培养液（10%新生牛血清，90%1640）。别人说Raji不好养，其实我觉得只要勤换液，这种也不难养；2.HL60和HL60/ADM同样也是半量换液；3.Molt4离心（800转，5分钟）后加入新鲜培养基；
  
  计划：明天观察细胞生长情况。Raji继续用新生牛血清这瓶培养基，其他三种细胞换用10%胎牛血清的培养基，希望能长好，那我就可以拿它们来种板做CCK-8实验了。细胞们，要加油哟！！

• bongte (2012-4-29 13:20:01)

  最近真的不知道学校的网络在想什么，老是出故障，完全上不了网。跑去问了网络中心的人，说是在维修，今天就可以上网了。但愿如此！
  
  今天老板叫我到中国大酒店去听讲座，是ELSEVIER主办的——Medical Statistics in Clinical Research and International Journal Publication.结果出门就堵车！广州的交通真叫人崩溃！停停走走，好不容易才到了会场，周围的人都不认识，第一次一个人出来，心里还有点小害怕(*^__^*)！不过，讲座开始之后就管不了这么多了。讲座都是说英语，我有好多都听不太懂。汗！真丢脸！要加强英语呀！还好有同声传译。不过从这次讲座中，我真的学到了不少东西，要好好的把它们用起来！老板给了我这么多的机会，我要好好争气！
  
  晚上回来虽然很累了，但还是到实验室给我的宝贝细胞换液。我自己的细胞从来不让别人帮我换液。这几天我的细胞除了Raji之外，其他的Molt4、HL-60、HL60/ADM状态一直不好，特别是Molt4，基本上只有40%是活细胞，纠结！！其他的HL60这两个耐药和不耐药的细胞株也不好，半死不活！Raji长得好，镜下观察，细胞数量较多，体积较大，圆形，折光性好，成团生长，呈葡萄状；HL60数量也很多，镜下观察细胞，发现同样是成团生长，而且团较大，我上次养过这种细胞，但细胞并不是成团，而是散在分布的，偶有细胞成小团聚集，这次为什么会出现这种情况？我考虑是因为复苏的细胞状态不好所造成的。不知道各位站友是怎样认为的。我上次养HL60/ADM时，观察到细胞是成团生长，而这次细胞却是散在的！偶尔看得到几个小细胞聚在一起，还死了一些，心痛！再养两天看看它们有没有什么变化。
  
  处理：1.把Raji吸走一半不要，再加入新鲜培养液（10%新生牛血清，90%1640）。别人说Raji不好养，其实我觉得只要勤换液，这种也不难养；2.HL60和HL60/ADM同样也是半量换液；3.Molt4离心（800转，5分钟）后加入新鲜培养基；
  
  计划：明天观察细胞生长情况。Raji继续用新生牛血清这瓶培养基，其他三种细胞换用10%胎牛血清的培养基，希望能长好，那我就可以拿它们来种板做CCK-8实验了。细胞们，要加油哟！！

• bongte (2012-4-29 13:20:22)

  
  前几天把前几天种的细胞给收了。得到了OD值，但是不知道该怎么算IC50，希望各位大侠给在下一些指点。
  两种细胞：Raji/HL60；
  96孔板，共设5组：空白对照（只有培养基）、阴性对照（含细胞的培养基）、A药（同一浓度）、B药（1um 5um 10um 15um 20um）、A+B药（浓度同B药）
  作用时间：72h/48h/24h
  得到一大堆OD值，但是我看了半天SPSS教程，还是不会算IC50。希望高人不吝赐教！

• bongte (2012-4-29 13:20:47)

  
  处理组和对照组的OD非常接近，都徘徊在0.17~0.19之间，用公式算出来的抑制率居然大于1！这是什么原因？我最后收细胞用的是Am Blue，培养了2h就上酶标仪了，波长为630。是不是培养时间不够？还是我的细胞被污染了？

• bongte (2012-4-29 13:21:24)

  今天用HL60/ADM铺了三块板，方法与前次相同，但是培养基的血清我用的是PAA的胎牛（很贵呀！！）。因为这个HL60/ADM我养了两次，用的是新生牛血清，都没养活；师姐用的四季青的血清，细胞的状态也不太好，半死不活的。我拿这个血清养着，细胞长得还很不错。
  加样的时候，发现100ul的枪头里总有一点点液体不管怎么都压都滴不下来。本来我加的细胞液就不多，才350ul，这样下来，我的误差就变大的。这是什么原因？是我的枪不好吗？阿

• utt0989 (2012-4-29 13:21:43)

  老兄 能不能换一下细胞 我有Daudi细胞 换你的Raji细胞 我做实验要用Raji 和 Daudi 我是军事医学科学院的！！ 你是？？？

• utt0989 (2012-4-29 13:24:27)

  今天用HL60/ADM铺了三块板，方法与前次相同，但是培养基的血清我用的是PAA的胎牛（很贵呀！！）。因为这个HL60/ADM我养了两次，用的是新生牛血清，都没养活；师姐用的四季青的血清，细胞的状态也不太好，半死不活的。我拿这个血清养着，细胞长得还很不错。
  加样的时候，发现100ul的枪头里总有一点点液体不管怎么都压都滴不下来。本来我加的细胞液就不多，才350ul，这样下来，我的误差就变大的。这是什么原因？是我的枪不好吗？
  
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  劣质枪头。。。
  我都在考虑用好点的枪头了。平时实验室买的就是一般的，1ml那种25左右一袋，配有些试剂的时候看挂壁在枪头上的那个心痛啊，总没配准。。。后来用了师兄的一个枪头（可能45一袋左右）才晓得为什么人家要用贵些的了，一点都不会挂壁的。我再看了下自己那枪头，灭菌过后居然是弯的，怪不得有时候前边会留一长截液体吹不出去，残留。。。劣质枪头，害人！我们那细胞培养的试剂动不动就是上千块1毫克的，你说这样配出来的试剂，自己心里都是虚的

• guagua (2012-4-29 13:26:04)

  
  我们都是不离心，直接放到培养基中，一开始培养基最好多一些，以减轻DMSO对细胞的毒害作用，4小时后，再对细胞离心，换液。我们这样复苏的细胞状态都很好呢。你不妨一试。