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[求助]G418加入到培养基中后培养基变黄，且高浓度下...

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2012-5-04 15:38    作者: one    来源: 分析测试百科网

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[求助]G418加入到培养基中后培养基变黄，且高浓度下...



大家好，最近要建立一个稳转细胞系，质粒什么的都已经构建好了，但是在确定G418筛选浓度实验中遇到了困难，实验步骤如下：买来的G418粉末，称取0.5gG418，加入5ml0.1M HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存；将配制好的G418储存液按一定比例加入DMEM中，100ul加入到10ml的DMEM中，G418浓度为1000ug/ml, 但是加入G418后培养基迅速变黄，该用水配也是同样的现象，记得以前用的800ug/ml的G418培养基也是不变色的呀；下一步是筛选了，将培养基稀释成不同的浓度梯度100—1000ug/ml，加入到已经贴壁培养的293细胞中，一周以后任何浓度下的细胞都生长的好好的，没有任何死亡迹象，重复试验，加大浓度细胞依旧不死，实在是找不到原因了，特来请教各位大侠，请大家多多帮忙分析一下，救救我吧！谢谢谢谢
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  • 园丁## (2012-5-04 15:39:26)

    首先我怀疑你293是不是密度种的太大了，因为293的转染效率是很高的，有可能大部分细胞都转进了质粒，这时候如果密度种大一点，G418的效果是很差的，所以在转染24小时后，我们一般都把细胞1：10或1：20稀释，贴壁后再加G418的。如果你经常做细胞的药物实验就会知道，细胞之间一旦结合起来，耐药性会大大提高的。
    还有就是G418是酸性的，你可以适当的调下pH值。不过呢，不去调问题也不是很大，因为细胞是耐酸不耐碱的，而很多细菌却是耐碱不耐酸。呵呵，放心去做吧。

  • one (2012-5-04 15:39:53)

    我现在做的是细胞转染前的筛选药浓度测定实验，就是要找到能够把正常未转染的细胞全部杀死的G418浓度，但是我已经把G418的浓度提高到了1mg/ml，未转染的细胞依旧是活的好好地，这样的话我就没有办法进行转染后的筛选了，细胞刚开始接种的浓度很稀的，同样细胞做的潮霉素的浓度梯度实验，在潮霉素150ng/ml时，细胞就已经全部死亡了，不知道G418的为什么不死！

  • bananapeople (2012-5-04 15:40:25)

    不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g，会不会是这个问题，你换个厂家的产品试试。还有抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

  • wu11998866 (2012-5-04 15:42:41)


    我觉得是G418的问题，你买的是那个公司的G418？
    如果是原装的，就没有问题。

  • hyuu (2012-5-04 15:43:03)

    293细胞还是293T细胞?
    后者的T就是G418筛出来的....
    hepes是PH7.3的吗?

  • 04906 (2012-5-04 15:43:31)


    G418是2-8°C保存，所以放在4°C，避光！

  • one (2012-5-04 15:44:00)


    是293T细胞呀，天啊，不会吧！！！293T细胞是用G418筛选建立的吗？有哪位战友有293T细胞的详细介绍呀，谢谢

  • 66小飞侠 (2012-5-04 15:44:42)


    详情请看ATCC：cuturl('http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-11268&Template=cellBiology')
    The 293T/17 cell line is a derivative of the 293T (293tsA1609neo) cell line. 293T is a highly transfectable derivative of the 293 cell line into which the temperature sensitive gene for SV40 T-antigen was inserted. 293T cells were cloned and the clones tested with the pBND and pZAP vectors to obtain a line capable of producing high titers of infectious retrovirus, 293T/17. These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.293T/17 cells were cotransfected with the pCRIPenv- and the pCRIPgag-2 vectors to obtain the ANJOU 65 (see ATCC CRL-11269) cell line.ANJOU 65 cells were cotransfected with the pCRIPgag-2 and pGPT2E vectors to obtain the BOSC 23 (see ATCC CRL-11270) ecotropic envelope-expression packaging cell line.ANJOU 65 cells were also cotransfected with the pCRIPAMgag vector along with a plasmid expressing the gpt resistance gene to obtain the Bing (see ATCC CRL-11554) amphotropic envelope-expression packaging cell line.
    57448: Pear WS, et al. Production of High-Titer Helper-Free Retroviruses by Transient Transfection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8392-8396, 1993. PubMed: 7690960

  • glass (2012-5-04 15:47:06)


    293t本身就是g418抗性
    正常情况下培养293t应含少量g418筛选
    另：高浓度g418加入培养基变黄很正常

  • star#room (2012-5-04 15:47:58)

    我也在做293细胞的稳定转染，但据我所知：
    “ By the way, if you use vector with G418 resistent, DO NOT
    use 293T, since 293T is stable incorperated SV40 large T antigen, it grow
    so fast that G418 could not kill the non-transfected cell. so using G418 in
    293T is useless.”
    这是我一个很有经验的人给我的建议.
    供参考.
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