[求助]MTT值偏低？为什么

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• pencil菲 (2012-5-05 15:36:06)

  
  你在做MTT之前要先看看每个孔内的细胞数量是不是和接种的时候一样，因为有的细胞贴壁能力差，这样就会因为细胞在换液的时候发生脱落，所以造成细胞密度的降低，MTT值也偏低。所以每次换液或加药后都要观察细胞数量是否发生显著的变化。
  另外，在MTT实验中，每次的吸液操作都要十分小心，以免生成的紫色结晶被吸走了，这也会造成MTT值偏低的。
  再有，你的平行孔之间的数值平行吗？

• hyuu (2012-5-05 15:43:25)

  
  吸掉加有MTT的培养基之后你可以在镜下观察一下，看看细胞数量有无减少
  如果细胞是长满的，那只能说明你的细胞活力比较低。
  MTT的OD值本身就不是和细胞数量直接挂钩的，而是和你细胞的脱氢还原酶有关，有的细胞活力很高，细胞达不到50％OD值就超过1.0，有的细胞活力低，长满了OD值也就0.3左右，这都是正常的。
  
  所以我们不能单纯以OD值来判断数据是否在线性范围内，而应该主要以细胞覆盖率来参考，一般阴性对照达到八九成满的时候是最合适的。

• kulee (2012-5-05 15:43:46)

  多谢赐教！
  我用的细胞是成纤维，贴壁很牢的，而且测48小时的OD值，不需换液。
  平行孔数值相差不大。如下：
  浓度  control  -7  -6  -5  -4
  OD值  0.307  0.317  0.303  0.295  0.321
  OD值  0.312  0.308  0.303  0.37  0.294
  OD值  0.352  0.303  0.302  0.302  0.33
  OD值  0.301  0.307  0.281  0.296  0.328
  OD值  0.288  0.317  0.288  0.297  0.312
  OD值  0.293  0.325  0.283  0.282  0.3
  
  现在只能怀疑细胞活力不够，但是前两天，用的P3代的细胞，OD值最高只有0.5，甚是奇怪。。。

• junjie05 (2012-5-05 16:17:40)

  个人觉得你溶解时间太短，溶解要过夜。

• kulee (2012-5-05 16:18:56)

  我可以试一试，但是如果没有差别，咋办呢？不管了，先试一下再说。多谢！

• fei1226com (2012-5-05 16:19:23)

  楼主是用3T3细胞吗？
  
  OD不应该太低吧！
  
  你加MTT后培养多长时间呀？另外加裂解液吗?我们裂解是过夜的。这一步很关键的。

• kulee (2012-5-05 16:20:37)

  我用MEF细胞，培养四小时就吸去培养基，然后加DMSO溶解，在摇床上混匀，大概10分钟的样子，就读板。
  没有用过裂解液。

• 49888 (2012-5-05 16:21:01)

  细胞数较少的时候用490nm读值。细胞量多时，可以用570nm对值。

• fklo83 (2012-5-05 16:21:27)

  我用MEF细胞，培养四小时就吸去培养基，然后加DMSO溶解，在摇床上混匀，大概10分钟的样子，就读板。
  没有用过裂解液。
  
  ——————————————————
  
  试一下培养过夜然后读板吧！

• kulee (2012-5-05 16:21:55)

  细胞数较少的时候用490nm读值。细胞量多时，可以用570nm对值。
  
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  不会吧，我是师姐说，我们的贴壁细胞都用490nm，波长跟细胞类型有关吧？

• yes4 (2012-5-05 16:22:16)

  
  借搂主宝地一用:
  我正在养人横纹肌瘤细胞(RD细胞).
  用96孔板做抗病毒实验,师姐让我每孔接种1X10的4次方细胞,24小时后接毒
  但发现这个细胞数24小时后还是稀稀拉拉的几个
  然后我就郁闷~~
  请问大伙接96孔板时,每孔大致接细胞的数量是多少呢?~

• yes4 (2012-5-05 16:23:37)

  
  根据自己实验细胞增值快慢情况而定，不过你的细胞接的好像应该少了些。
  
  具体接种多少细胞，自己去摸索一下。我们接的2*10五次方。

• kulee (2012-5-05 16:24:23)

  根据自己实验细胞增值快慢情况而定，不过你的细胞接的好像应该少了些。
  
  具体接种多少细胞，自己去摸索一下。我们接的2*10五次方。
  
  ——————————————————————————
  
  楼上的经验很受用!
  如果方便的话,请问一下您的细胞品种和接种目的.
  如果涉及科研机密,就不要说了哈~~

• kulee (2012-5-05 16:36:53)

  
  还是MTT的问题，波长跟什么有关？我们一直用490nm。发现很多文献用的570nm.到底有什么不同呢？

• cj_mondy (2012-5-05 16:37:16)

  
  我是养人脐静脉内皮细胞的，和LZ的细胞做的MTT结果一样，我的大概是一个96孔板的孔钟1万5千个细胞，然后培养48h，加药处理后加MTT,加DMSO溶解后测OD值，重复了很多次都是0.3的值左右很少有高过0.4的，我得细胞活性还可以，虽说是原代，但我是用的第一代的细胞坐的，细胞48h小时后长得满满。。。。我开始以为是密度或者MTT粉过期或者是DMSO出了问题，后来一个个排查，觉得应该是不同细胞的琥珀酸脱氢酶活性是不一样的，也就不再单纯追寻高OD了，能反应组与组之间的差别

• cj_mondy (2012-5-05 16:37:42)

  
  能反应组与组之间的差别就可以了