[求助]细胞消化传代的相关问题

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• ending (2012-5-05 16:42:46)

  细胞传代不一定要离心；
  胰酶加EDTA更易使细胞分散开，像你说的成团生长，不易吹打开的细胞，最好用胰酶加EDTA。

• 一叶 (2012-5-05 16:43:41)

  1，不一定离心，分情况而定。如果消化时间控制的好，在显微镜下观察到细胞连接处分开，细胞还没有漂起，吸弃消化液时细胞不会损失，就不用离心，直接用含有血清的培养基终止消化，并再系弃培养液，再加培养液吹打。 如果消化过久，细胞也悬浮，防止丢失细胞，就需要离心。
  2。做细胞凋亡不需要低温离心机。
  3.首先明确消化液的作用原理。胰酶的作用是使细胞间的蛋白质分解从而使细胞离散，不同的组织或细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与浓度，温度和作用时间有关，在PH=8，温度为37°时，作用力最强。所以要把握好浓度，温度和时间。EDTA不能被血清中和，如果回收培养瓶再用，要彻底清洗，否则细胞容易脱脱壁。本人建议在购买细胞处询问消化用什么，多大浓度最好。如无从查证，两者都可以尝试。本人养了三种细胞用什么消化都没问题。另外细胞成团可以充分吹打分散，在培养瓶先事先加入少量培养液，浸没整个瓶底再加入消化好的细胞。

• kuohao17 (2012-5-05 16:43:58)

  今天我无意中消化的比我平时时间长了些，看到细胞都一个一个分开了，在我看来是消化过度了，吹打时没吹几下就散了，我就想，是不是我之前太怕消化过度了，吹下来的细胞都是像一层膜一样揭下来的，根本不可能吹散，是不是应该像今天一样，细胞都分开，但是没有掉下来才终止消化呢？

• wu11998866 (2012-5-05 16:44:18)

  
  个人经验，仅供参考
  细胞在消化时，去除培养基后，可以先用PBS洗一下，也可以直接加入少量消化酶（胰酶加或不加EDTA）将培养基中和一下后，立即去除，然后再加入消化酶，一定要掩盖住瓶底，这时不要晃，待镜下看见细胞变圆后，再轻轻吹打即可。

• kuohao17 (2012-5-05 16:49:47)

  
  我就是这样做的 我的细胞是肿瘤细胞 不会变圆，开始会鼓起来，立体感很强，那时候我就会吹，细胞长的又密，像一层膜一样被揭下来，于是就很难吹散了

• yysr238 (2012-5-05 16:52:35)

  消化过度和细胞损伤的问题个人体会：
  
  1.消化的时间：说明书上推荐是5min内，但要看细胞的类型，酶质量的好坏，还有就是室内的温度。比如说肿瘤细胞就比较好消化，用GIBICO配置好的酶0.5－1.0ml就可以消化很大瓶子的细胞了。但上皮类的细胞就很难消化，如前列腺增生细胞HPH－1，用3ml都没有问题，细胞不容易脱落，也不会死。如果是在冬天，还要把培养瓶放到培养箱，这样能使酶在它适当的温度发挥更好的消化功效，或者是用手掌捂隹瓶子加温也可以。
  
  2.使细胞脱落：可以用吹打的方法或手拍瓶子的方法。问题都是容易起泡泡。我经常使用的是手折瓶子方法。怎样才让它不起泡泡呢？我的体会关键上握瓶子的手要固定不到，要平稳；另一只手水平用力，可以拍很重都没事（但最好不要那么用力），而且消化下来在细胞也很分散。但如果拍完第一次之后，如果想再继续拍，这时候又容易起泡泡了。具体是什么原因，还不清楚。

• lagua123 (2012-5-05 16:52:58)

  
  结合本实验室的经验，就上述问题体会如下：
  1.细胞传代一定要离心吗？
  不一定，视细胞类型而定，我养过平滑肌细胞和小鼠Raw264.7细胞系，比较了离心和不离心的区别，结果不离心细胞状态更好，基本上100%贴壁，离心种板后第二天还需要换液，总之，细胞状态好事硬道理。
  2用流式做凋亡的时候离心要用低温离心机吗？
  最好使用4度离心，1000rpm（500g）左右，可以从R &D公司还有BD公司下载protocol，都是要求低温离心的。
  3消化细胞用胰酶好？还是胰酶+EDTA
  如果用胰酶+EDTA 消化会更好，但是要降低胰酶浓度，因为EDTA的消化作用比较温和，这样比较容易消化成单细胞悬液，这对于流式上机检测是十分必要的。希望对楼主有帮助。

• zzzz (2012-5-05 16:53:19)

  
  我的经验是离心800转/2分，细胞传代效果好

• 04906 (2012-5-05 16:53:35)

  我们实验室都要离心，消化只用胰酶，时间为1.5分钟。吹打的时候也容易起泡泡，不知道怎么解决。

• jujuba (2012-5-05 16:53:57)

  
  我的经验同前面所说的，用PBS洗一下后再加胰酶，细胞易消化，易吹散。