[求助]用myc做免疫共沉淀，沉不下来

最新回复

• junjie05 (2012-5-09 19:32:42)

  
  您提的问题描述太简单，都不知道从哪开始回答，请你把具体实验步骤叙述一下，我帮你看看。

• kuaizige (2012-5-09 19:33:03)

  先提蛋白，然后加beads(santa cruz,ge,罗氏都用过，主要用的是protein g beads ，我的myc是鼠的IGg1抗体)预澄清4h，然后去掉珠子，加myc的一抗，4度轮转1或2小时，再加beads，过夜，4度，轮转，第二天早上洗珠子，加2*SDS煮样，接下来和western步骤一样，上myc和我要拉的基因的一抗，过夜，然后再用二抗，ECL发光，但myc自身总是显不出来，多谢了。

• junhun (2012-5-09 19:33:23)

  
  先确定一下你的myc抗体能做IP么？protein G beads有没有问题？与你的蛋白的表达量有没有关系？Co-IP的蛋白能检测出来么，会不会因为你这个myc蛋白的表达量太低导致检测不到？
  还有个可能性是你的蛋白把myc tag折叠在里面，抗体不能跟tag结合，而WB时经过变性使tag暴露了出来能够检测到

• kuaizige (2012-5-09 19:42:11)

  
  能做ip，sigma的，珠子是别人做出来过的，也没问题，co-ip也很强，无意中myc做出来过一次，但是再做很多次就重复不出来了，也不知为什么

• TAT (2012-5-09 19:42:45)

  能不能换个抗体去显你的myc蛋白？
  我遇到过类似的情况，蛋白表达比较弱，IP后检测换了个比较强的抗体才能看到

• kuaizige (2012-5-09 19:43:36)

  QUOTE:

  原帖由 TAT 于 2012-5-9 19:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  能不能换个抗体去显你的myc蛋白？
  我遇到过类似的情况，蛋白表达比较弱，IP后检测换了个比较强的抗体才能看到

  谢谢，我换过一次还是没出来

• 一叶 (2012-5-09 19:43:59)

  QUOTE:

  原帖由 kuaizige 于 2012-5-9 19:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  
  谢谢，我换过一次还是没出来

  还没有做出来么?你从下面几点考虑下吧：
  1 、 Myc的抗体很多公司都做，但是效价好像差的很远。SIGMA的我们没有用过，但是我们以前用invitrogen的，有很多蛋白表达后都检测不到或者条带很弱，但是最近换了upstate的抗体，发现同样的样品，upstate的抗体灵敏性明显要高。
  2、 你用的是多抗还是单抗？做免疫沉淀时，多抗的效果更好一些，如果用单抗的话，可能需要增加抗体的用量。
  3、你做IP的BUFFER是什么配方？BUFFER里面的去垢剂浓度和盐离子浓度还有PH值都会影响到抗原和抗体的结合。一般来说，去垢剂的浓度不要太高，尤其是离子型去垢剂，如SDS，分子克隆上说不能超过0.2%,个人经验觉得做CO-IP的时候最好不要用离子型去垢剂,当然这个也和抗体有关.
  4、既然是做CO-IP，你可以换用另外一个蛋白质的抗体去沉淀，确定你做IP的方法没有问题。
  GOOD LUCK！