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[求助]筛选细胞单克隆稳定株的好方法
[求助]筛选细胞单克隆稳定株的好方法
发现做细胞稳定株时，不同人有不同的方法。不过我看见很多人做得很累，也未必能得到稳定株。所以我打算将自己的经验和方法总结一下，供大家讨论参考。
材料：
细胞：CHO
质粒：筛选基因和目的基因共表达的质粒
转染试剂：Lipofectamine2000
操作：转染→混合板培养及检测→单克隆培养及检测
转染：主要按照Lipofectamine2000说明书进行。见其Plasmid DNA Transfection ，按Adherent cells进行。说明书推荐DNA用0.8μg，实际我们在估计DNA的量时，每个人估的结果相差很远。不过DNA加多点加少点，问题并不大，只是影响有表达的单克隆数目而已。下面还是详述一下转染步骤。在24孔板中以约0.5-2*106的细胞数量种板，一般要多种一孔细胞，不做转染的，用于做阴性对照。第二天，换上新鲜培养基，准备转染。将DNA和50μl IMDM或DMEM混合。在另一管中，将Lipofectamine2000与50μl IMDM或DMEM混合，静置5min。然后将两管的内含物混合均匀，静置20min.把混合液加到CHO细胞培养基里，轻摇24孔板，使液体混合均匀。置入培养箱，24h后，胰酶消化已转染的细胞，将全孔的细胞铺到直径10cm的细胞板上，换上新鲜的培养基。
混合板培养及检测：
第二天，换上选择性培养基。我的经验是，加入两种选择元素可以大大增加得到有表达株的得率。在做缺陷型CHO细胞时，我试过只用无HT的培养基进行选择，也试过除了不加HT以外，还加入另一种抗生素培养.结果，前者得到的表达株很少，大概十分之一的细胞有表达；而后者，则是百分百的细胞有表达。
从这第二天开始，大概每过三四天就换一次选择性培养基。而且每天观察细胞。你会发现，刚稀释的细胞稀稀落落能将10cm的细胞板覆盖。但过了几天后，细胞开始凋亡。不同的选择性培养基，细胞凋亡的方式有所不同。为了更好地观察，最好之前做个预实验，将未转染的细胞在相应的选择性培养基下培养，观察其死亡的方式和形态。如果只用无HT的培养基，细胞不会程序性死亡，它只会老死。这个过程比较慢，一般来说，缺陷型CHO在不含HT的培养基培养一周后仍然是活着的，但它不能分裂。至于这种情况下缺陷型细胞最多能活多久，我就没有研究过了。如果用G418作选择性培养基，则细胞是变小变圆后，漂浮起来而死的。一般在加入G418后10天左右发生作用。如果用Zeocin培养，细胞就不是变圆变小，而是直接在原处变扁，核变大，最后细胞膜也不存在了。当然，其死后的碎片也会漂在培养基中。相对来说，G418引起的死亡是最容易辩认和观察的，而Zeocin引起的死亡则有点难辩认，无HT的培养基就只能靠“等”其死亡了。
在这段时间里，除了观察到原来的细胞死亡之外，还会看见一些细胞开始分裂而形成一个个细胞群落。有人在这个时候就开始挑单克隆了。这个时候挑到的单克隆也许并不稳定。所以我没有在这个时候挑，我让这个10cm细胞板里的细胞继续生长死亡。我只是每天观察换液。细胞群落越分裂所占面积越大，直到群落与群落间连接起来了。这段时间或者稍后点的时间，还可以观察到第二轮死亡。G418培养的细胞比较容易观察，而其它两种选择性培养基则较难观察。但不管我们有没有觉察到，这第二轮死亡是在进行着的。很好理解，第一轮死亡的细胞是没有转染进DNA的细胞，所以死得最快。这第二轮死亡的细胞也许是DNA转染进细胞了，但没有整合进染色体；也可能是整合进染色体了，但所在位置不稳定，目标蛋白的表达对细胞产生毒性。这些细胞都活不久，所以进行着第二轮死亡。如果不等细胞板里的细胞进行第二轮死亡而匆匆挑单克隆，这一轮死亡就会发生在挑完单克隆之后，表现为所挑的单克隆不稳定。
等第二轮死亡完成后，剩下的细胞一般都是比较稳定的。这时，换上少一点的培养基，然后过三四天，就可以检测培养基或消化点细胞来检测细胞内有无表达了。确定有表达之后，再挑单克隆，就信心百倍了。不过，也有可能混合板里的表达量很低，未必能检测得到。
在我使用过的选择性培养基来说，从第一次换选择性培养基开始，大概都是经历20天，就可以完成第二轮死亡了。其它选择性培养基的具体情况就不太清楚了，最好用未转染的细胞做做预实验，看进行一轮死亡要多长时间。
单克隆培养及检测：
这个时候，要挑单克隆了。别怕细胞已经长满了整个10cm细胞板。因为在细胞刚开始分裂的地方，那里的细胞是最厚的，在日光灯下就可以看到。将这些细胞最厚处的细胞用黄枪头刮下来，放到96孔板里。要注意，无论是用96孔板还是用24孔板，如果要检测培养基里是否有表达的话，一定不要使用外围的孔。因为那些孔蒸发得很快。但这些孔里面也一定要有液体，才能保证里面的孔少蒸发，而且周边环境一样。
96孔板里预先加一点胰酶，细胞放进孔里后，让其消化一下，然后加入培养基，吹打分散细胞。细胞经过分散之后，会长得比较快，而且长得比较均匀，便于后面判断是否可以检测细胞。96孔板里的细胞可能会长得很快，要每天观察，培养基变色了就马上换。细胞长到一定数量时，也有可能分布不均匀，再用胰酶消化，加入培养基吹打，使其分布均匀。
如果要检测的是培养基，那么，下面的问题不存在。如果要检测细胞，那么，就要想办法保留点细胞。要么待孔里的细胞分裂到一定数目，再种板，每孔细胞种两孔。要么就是取细胞检测时，不要将loading buffer直接加入孔里，而是用胰酶消化细胞取走。这样，孔里总会剩下一点细胞，就再加入培养基，让这些细胞重新长起来。
细胞长满孔后，就可以换培养基，两三天或更长时间后取样检测了。如果要挑最高表达量的细胞株，就要统一取样时间的标准，因为各孔细胞的原始数量不一，所以生长速度也不一。比如，要细胞汇合度达到100%时，换液，72h后取样检测。
流程小结如下：
种板→转染→稀释→换选择性培养基→混合板经历两次死亡→检测混合板是否有表达→挑单克隆→检测筛选高表达株
讨论：
我知道筛选单克隆的方法因人而各有不同，具体操作可谓相去甚远。我以这个方法成功筛选单克隆已经有四次了，是百分百的成功率。其实该方法的亮点在于混合板的培养。有很多人并不注意这个步骤，因而花费了很多功夫，最后发现得到的单克隆不稳定，要么培养多两代就死了，要么保种后复苏就死了。我自己就试过一次，没有做混合板培养这一步，结果发现挑到的单克隆大多数不稳定。有的会死掉，有的虽然活着但丢失了目标蛋白的表达，有的保种复苏后也没了目标蛋白的表达。因此，我觉得现在用的这个方法很好。
有的人担心混合板培养后，实际上单克隆之间已经互相混杂在一起，挑单克隆时其实挑到的是混合株。那么，我要说：是的。这种方法的确可认为挑到的是混合株。不过它的混合程度不高，就是说，所谓的“单克隆”可能最多就是四五株真正的单克隆的混合。但是，我们真的需要真正的单克隆吗？其实很多实验是不需要真正的单克隆的，只要有表达了就已经满足需要了。这个时候，就不需要再理会是否为真正的单克隆了。其实，即便一开始是真的单克隆，在培养数代后，也会有分化的。另一情况下，当我们需要真正的单克隆时，只要把这株所谓的“单克隆”稀释成非常稀的浓度，铺在直径10cm细胞板里，就可制备成单个的细胞，那么就可以得到真正的单克隆了。而这样做，比起一开始就把转染细胞稀释成非常稀去制备单克隆，又省力又保险。也许还可以省时间，因为跳过混合板这步，得到的细胞多数时候是很不稳定的，结果又要从头开始做了。
这个方法虽然好用，但我还没有其它细胞中尝试过。而CHO细胞，其野生型和DHFR缺陷型我都试过了。当然，有些细胞很容易得到稳定的表达株。CHO细胞在表达鼠源基因或带鼠源信号肽的蛋白时，也很容易得到稳定株。这些时候就不需要经过混合板培养这一步了。
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最新回复
ending (2012-5-10 17:05:55)
请教楼主,我转染的是HEPG2,使用G418筛选,在经过20天筛选后,我直接消化传代,然后扩大培养,再准备做表达检测,没有进行单克隆挑选,不知这样行不行,
october7 (2012-5-10 17:06:30)
二楼的，进步进行单克隆挑选看你的实验要求．瞬时表达也能收集少量样品．
kswl870 (2012-5-10 17:06:52)
了了 (2012-5-10 17:07:43)
ritou1985 (2012-5-10 17:09:03)
因为如楼主讲的“比起一开始就把转染细胞稀释成非常稀去制备单克隆，又省力又保险。也许还可以省时间，因为跳过混合板这步，得到的细胞多数时候是很不稳定的，结果又要从头开始做了。”我们在做细胞融合筛选阳性克隆时也常遇到。
有一点是，我们要的阳性细胞负担着分泌抗体的重任，所以总容易被非分泌细胞竞争抑制生长，所以我们的克隆一定要100%纯。
utt0989 (2012-5-10 17:25:20)
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