[转帖]HSC肝星形细胞成功的经验

最新回复

• 铜雀 (2012-5-12 16:34:42)

  应该不是3200 g梯度离心。

• 911 (2012-5-12 16:35:13)

  3200g 是否过大？，看很多人的Nycodenz 都是1400g，离心。没有试过，不清楚这个3200g离心力下，是否HSCs还留在上层。
  
  沉淀细胞，我用到了1400g为止，细胞物理性破坏的少。1700g不清楚。但是一般常规的450g足够把所有的细胞沉淀下来。

• fsdd817 (2012-5-12 16:35:50)

  我还没有成功，实验做的很不稳定。我一定要原代的细胞，而且数量大。所以操作必须稳定且熟练。

• 3648755 (2012-5-12 16:40:03)

  3200g 是否过大？，看很多人的Nycodenz 都是1400g，离心。没有试过，不清楚这个3200g离心力下，是否HSCs还留在上层。
  
  沉淀细胞，我用到了1400g为止，细胞物理性破坏的少。1700g不清楚。但是一般常规的450g足够把所有的细胞沉淀下来。
  
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  I believe that's 3200 rpm, not 3200 g.

• fsdd817 (2012-5-12 16:43:10)

  I believe that's 3200 rpm, not 3200 g.
  
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  是啊，但是总得给r=？cm吧

• fsdd817 (2012-5-12 16:43:59)

  
  我在第二个帖子里特意指出那个速度是有问题的
  
  具体是多少rmp，大家得按照自己使用的离心机转子的直径进行计算，不过一般有多少g的吧。

• fsdd817 (2012-5-12 16:44:21)

  一些成功的经验贴
  
  juncaous
  
  你只要在倒置荧光显微镜观察，即可看到肝星状细胞自发荧光，象营火虫一样一闪一闪发光，，很漂亮的。至于波长我觉得不是主要问题。
  你先用链蛋白酶、胶原酶、DNAase 消化后，然后分散细胞，再密度梯度
  现提供你密度梯度方法;
  ⑴28.7% Nycodens 17.4ml +BSA/HBSS（Na+）21.5 ml+ DNAsesolution 3ml混合后分加三管，（即每管含28.7% Nycodens 5.8ml）再分加BSA/HBSS（Na+）或MEM medium于三管，各管终体积均为20 ml ，各管Nycodens终浓度均为8.2%，（用BSA/HBSS，提的HSC的浓度更纯)。小心地在上铺盖一层BSA/HBSS 或MEM medium 10 ml左右，各管最终体积为30ml。4℃，3200×g，15～20min离心。垂直小心取下离心管。弃少量上层MEM medium，再仔细吸取MEM medium与细胞悬液界面之间的细胞，即HSC；再将吸取的HSC加适量的MEM在4℃，1700×g，7min离心洗涤俩次。以20%的199 medium进行培养，48h换10%的199 medium。
  
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  这个红色标出来的话，怎么理解阿？呵呵

• fsdd817 (2012-5-12 16:44:57)

  
  感觉BSA和牛血清的成分有些接近，请问tk57ml你做的实验有没有用DMEM终止做尝试？

• fsdd817 (2012-5-12 16:46:31)

  感觉BSA和牛血清的成分有些接近，请问tk57ml你做的实验有没有用DMEM终止做尝试？
  
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  还没有试过，请问你是一直用 DMEM无血清去终止的吗？

• 66小飞侠 (2012-5-12 16:48:09)

  我的标准文献是参考XLM的，他做人的。有讲到详细的步骤，用的是DMEM+DNaseI去洗涤2次。
  
  我很相信这篇文章的实验步骤，我现在培养的细胞24小时后就开始铺展了，不规则的三角或四角突起，明天换液后再交流。

• 49888 (2012-5-12 16:48:36)

  
  Can you kindly post the detail operation please? Thank you!
  I am recently isolating HSC, however, I want to improve the purity. The method I always use outcomes low purity although HSC cells.

• hot_hot_hot (2012-5-12 16:55:59)

  我的标准文献是参考XLM的，他做人的。有讲到详细的步骤，用的是DMEM+DNaseI去洗涤2次。
  
  我很相信这篇文章的实验步骤，我现在培养的细胞24小时后就开始铺展了，不规则的三角或四角突起，明天换液后再交流。
  
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  请问，你这个DMEM+DNaseI去洗涤2次的时候，DMEM的温度是37度吗？如果不是的话，岂不加入DNase由于温度不够而无法发挥其酶活性？
  
  因为，终止之前的collagenase的时候所加入的血清是低温的，所以整个系统的温度已经降下来了，那么之后的DMEM+DNaseI去洗涤2次时候加入DNase是否有意义？

• fsdd817 (2012-5-12 16:58:41)

  
  呵呵，感觉DNAaseI像是安慰剂。
  
  我在培养基中加入双抗也是安慰剂作用。在切肝脏的时候，我发现一根鼠毛。但是培养液没有双抗，由于担心，我在4-6小时时加入了双抗，意外发现细胞在那个时候已经贴壁。

• fsdd817 (2012-5-12 16:59:07)

  
  其实在一篇中文文献中,XLM提到了更为详细的操作步骤，的确不是4度而是25度

• fsdd817 (2012-5-12 16:59:34)

  大家自己去搜搜吧。太大了，可能会收不到。
  是关于人的HSC永生系。

• dragonkilly (2012-5-12 17:00:03)

  请问能2个问题，
  
  1 我不太懂解剖，这个中文论文中说“迅速剪断 前腔静脉放血” 请问这个前腔静脉是哪根？
  
  2 这个中文论文中一开始灌注的时候就用pronase，请问有什么意义吗？
  
  谢谢

• rxcc33 (2012-5-12 17:00:32)

  
  这个是用两种酶灌注，肝叶软化的速度变快，离体消化就容易些了（pronase主要用于非实质细胞分离时的原位消化，可以特异地破坏实质细胞）。前腔静脉好像是从胸腔进入肝的静脉，实际上人体的血液循环就是从上腔静脉到门静脉的。