[求助]心肌细胞培养求助？好久贴壁？如何分辨

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• KGZ564 (2012-5-14 13:22:32)

  
  这是培养24h的心肌细胞，未见搏动，有很多细胞碎片，不知是不是心肌细胞啊？40h的时候换了液，发现竟然把大部分细胞给换了，难道这么久了心肌细胞还未贴壁？请高手赐教

  
  50686970.jpg

• 园丁## (2012-5-14 13:22:54)

  
  40h心肌细胞已经贴壁了，换液不会将细胞换掉的，一般48h搏动现象就比较明显了。辨别心肌细胞与成纤维细胞除了观察有无搏动，还可通过免疫细化的方法加以区别。具体方法及步骤可在版内搜索。您说的换液后细胞大大减少意思是换液前细胞数量还是很多吗？消化或差速贴壁后得到的细胞的数量如何呢？

• utt0989 (2012-5-14 13:23:16)

  
  看了你的图，感觉你消化有问题，换不换液都没啥影响，而且也没有用。好的细胞换液也冲不掉，冲洗的也是死细胞（何况死的心肌细胞也是附着于其他心肌细胞上，也冲不走）。所有感觉你种细胞时，细胞就已经大量死亡或膜损伤。鉴别呢，我养的，一般过夜后就会搏动，而且均一性，很亮，我一般根据实验目的选择消化力度和时间，事实上我喜欢靠感觉，就是乳鼠的树目，大小，还有我剪碎的大小而且调整消化方法和力度。
  建议调整消化步骤，当然首先要保证取材快，我取出心脏时，洗心脏时，不用我去碰，都会自己喷血。乳鼠2天的好，1天和3天，我认为不行。胎鼠的我也养过，还是养神经元比较好。
  祝 实验顺利

• 3648755 (2012-5-14 13:23:32)

  
  细胞需要差速贴壁培养 因为消化后有心肌成纤维细胞和心肌细胞 成纤维细胞2小时就贴壁完成 因此可以通过差速贴壁的方式，让成纤维先贴壁然后吸上清再种到一个新的平皿，预先铺明胶促进贴壁 我成功了 祝你顺利！

• KGZ564 (2012-5-14 13:24:12)

  
  四楼的高人，我想问下你是如何消化的？我是每次消化10分钟，后吹打1分钟，静置后取上清终于消化，离心的900转离10分钟，酶用的是0.125%胰酶

• 3648755 (2012-5-14 13:24:32)

  首先用0.8％胰酶4度消化过夜 第二天用胶原酶34度消化就可以

• KGZ564 (2012-5-14 13:24:48)

  
  你养得是什么心肌细胞啊，要消化这么久，我都是出生24小时的SD大鼠，最多消化半小时吧，还用得0.125%的胰酶

• 3648755 (2012-5-14 13:25:33)

  
  错了 0.025% 不好意思 4度过夜 效果很好。也是SD大鼠 小鼠也是这个条件 没有问题

• KGZ564 (2012-5-14 13:26:02)

  
  我想问下，细胞搏动是如何判断的，是要一簇细胞一起搏动还是单个细胞都能搏动呢？还有想请问下大家，取原代的时候撕去了心包膜了么？因为心包膜里的纤维细胞较多，但是这个步骤不好操作啊

• 园丁## (2012-5-14 13:27:12)

  
  有单个细胞的搏动也有成簇的搏动，个人认为成簇的搏动更具有说服力。
  尽量撕去心包膜吧，如果弄不干净的话1.5-2小时的差速或通过添加Brdu也可将大部分的成纤维细胞去除。

• KGZ564 (2012-5-14 13:27:43)

  
  我又重新养了一批，这是过夜后第二天的照片，我不知怎么样才算搏动，好像有，请大家看看照片帮我分析下是不是心肌细胞吧，谢谢！
  

  
  47421046.jpg

• 3648755 (2012-5-14 13:28:11)

  
  搏动是很明显的 整体一起搏 不过不处理确实不是很厉害 如果用PE处理就使劲动呵呵，从图上看挺象的，成纤维细胞是典型的梭状
  
  园丁##，我就是用含BRDU的培养基 差速贴壁2小时，效果很好

• wsll (2012-5-14 13:29:11)

  
  第二张图片细胞看起来很多杂质，是不是有很多组织块和胶原啊？
  第一张图片看着细胞很像是污染了，所以才会有很多组织碎片，换液才会出现细胞变得很少。可以加双抗防止。
  我是用的37度水浴，多次消化，效果很好。

• KGZ564 (2012-5-14 13:29:53)

  
  请问PE是啥啊？BRDU的性状是如何的？粉末还是液体呢，贵不，我们实验经费有限啊

• 园丁## (2012-5-14 13:30:18)

  请问PE是啥啊？BRDU的性状是如何的？粉末还是液体呢，贵不，我们实验经费有限啊
  
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  PE应该是苯肾上腺素（phenylephrine）？要看自己实验的情况，在这里仅仅是给予心肌细胞一种处理或刺激因素，要根据自己的实验设计来，没必要添加。
  Brdu 大概的价格400元（1g,SIGMA公司。）

• KGZ564 (2012-5-14 13:31:15)

  这是换液了以后的照片，第三天了，请大家帮我看看，我没看到很明显的搏动，不过好像有一些细胞团在微微搏动，不知这些是不是心肌细胞呢

  
  31424997.jpg

• dragonkilly (2012-5-14 13:31:48)

  
  首先，楼主的照片应该说清楚是哪个倍数的照片，个人认为你的倍数比较低，要么就是细胞太少，我几乎看不到贴壁的细胞。建议在20x照相。
  其次：照相的时候可以适当把镜头拉的近一点。也可以起到放到的作用。
  总体感觉：第一张：消化过度；第二张杂质（？？）比较多，要么就是照相技术的问题了。第三张：看不清，给我的感觉是还没有贴壁呢。
  
  昨天刚做的一批乳鼠心肌细胞培养，24h换液，细胞有搏动，但是不多。
  我们这里都是24h就换液了。贴壁的也比较好，只是我觉得我这次操作消化的不够充分，接种时发现细胞团比较多，导致差速的1，2瓶中都有细胞搏动。我准备下次消化充分，差速1次，24h换液。
  我的简单过程：
  消化3次：第一次5分钟，弃上清；第二次加酶后，10分钟，2次，中间不换酶。
  贴壁2次,75min/次。因本次操作感觉差2后细胞贴壁不多，准备下次贴1次就行。
  
  问题：看楼主是48h换液，我是24小时换液？有空试试效果。
  
  总结：一个不断摸索的过程，各个实验室条件不同，多思考，多记录，多改进，相信自己，肯定能成功，共勉！