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[求助]关于流式检测GFP的问题
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如题，流式检测GFP表达需要什么特殊处理么？如细胞通透性处理。
小弟我是要把带有GFP标记的质粒转染进细胞中，用流式检测转染率，做了2次，荧光显微镜下能都看到GFP表达，而用流式检测一次有一次没有，唯一的区别是前者用了含FCS 叠氮钠 甲醛的PBS固定，后者只用了PBS悬浮细胞检测。
哪位战友能对这个问题做一个详细的解答 谢啦
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最新回复
newway (2012-5-14 13:52:41)
流式检测GFP转染效率不需要固定细胞，也不需要通透性出来，只要把细胞制备成细胞悬液，并调整密度到10的六次方左右就可以上机检测了。记得准备没有转染的阴性对照。
bamboo16 (2012-5-14 13:53:04)
newway (2012-5-14 13:53:23)
我不清楚你的转染是单纯的GFP转染还是GFP与其他蛋白连接的质粒再转染，我觉得单纯从这个图本身而言表示不同细胞表达的GFP的含量不一致，所以反映出来的荧光强度也不一致。我以前帮别人做GFP转染效率的结果跟你的也比较类似的，阳性细胞的荧光强度分布也比较分散的。
dongdongqiang (2012-5-14 13:53:40)
你收的细胞数量太少了！多一点1w看看结果就会好看很多的！
bamboo16 (2012-5-14 13:54:03)
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我转染的是带GFP标记的RNA干扰质粒，应该不存在和其他蛋白连接。
从图上看，似乎在强度10的4次方后边仍有细胞，但超出了检测范围，这样会影响阳性率的计算的，不知道这个问题能解决么？
bamboo16 (2012-5-14 13:54:33)
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我的实验组和阴性对照组都是计数1W个的啊，我也奇怪怎么峰值比对照差那么多，是因为我上边提到的有细胞超出检测范围而没显示在图里的原因么？
HP007 (2012-5-14 13:54:53)
如果你转染的基因实在胞内表达的话，你就要进行细胞通透性处理的，这样才能检测到GFP.
49888 (2012-5-14 13:55:20)
如果你转染的基因实在胞内表达的话，你就要进行细胞通透性处理的，这样才能检测到GFP.
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在胞内表达就要作细胞通透性处理吗？ 记得GFP本身就会发出荧光的，荧光是细胞膜（透明的）档不住的。
这个GFP不是用荧光抗体去检测胞内蛋白。
bamboo16 (2012-5-14 13:55:48)
如果你转染的基因实在胞内表达的话，你就要进行细胞通透性处理的，这样才能检测到GFP.
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要做通透性处理么？荧光显微镜先是可以观察到的。我记得做通透性处理是为了让染料进入细胞内吧，GFP应该是不用染的。
我有点糊涂了，其他群友的意见呢？
8964357 (2012-5-14 13:56:13)
不用通透处理的，我帮人做过很多次转染率的检测了。转染的各组细胞量较少是可能是因为图中给出的是根据FSC/SSC圈门后R1门内的细胞，可能是转染造成细胞死亡、细胞碎片比较多，门内细胞相应就比较少了。GFP本来就能发荧光的，不用再标记了。
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