[求助]293T细胞长得慢

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• hot_hot_hot (2012-5-16 12:43:01)

  
  呵呵，楼主，出现这种情况最选考虑的是你的复苏过程有问题，没有迅速复温到37℃。建议楼主可以这样做：
  1、先将一瓶完全DMEM培养基预热到37℃左右，然后吸取5ml置于一无菌离心管中，盖无菌盖，待用；
  2、将水浴箱恒温在37℃；
  3、从液氮中或-80℃冰箱中取出冻存细胞，迅速在水浴箱中复温片刻（要注意不要浸染），待冻存管内的冰冻液体能够与冰存管分离时，迅速将冻存管内的“冻珠”倒入装有预热DMEM的离心管中，轻摇，此时冰珠会迅速溶化，从而使细胞迅速复温到37℃。
  4、800～1000r/min，离心5min后，弃上清，加入完全DMEM重悬细胞，放入无菌培养瓶中培养。
  其实第2、3步时，我们都不用水浴箱，就是用手把冻存管捂一捂，到能把冰珠倒出来主就行，效果相当好。比用水浴箱溶化好。
  
  如果楼主确认自己的复苏过程都没有问题，那么可以考虑把FBS加大到20％（最好用进口血清），这样有利于细胞的生长，但也有加速细胞老化的可能。
  如果以上都做好了，细胞还是不贴的话，呵呵，那就要怀疑细胞在冻存时的状态就不好，活力太低，或是传代次数太多，细胞已经老化了。
  祝好运。

• mamamiya (2012-5-16 12:44:23)

  
  除了以上原因，建议再查哈孵箱，看看孵箱的温度，CO2浓度和孵箱内的去离子水还也没有。往往这样的问题是比较容易让大家忽视的。
  曾经遇到过因为箱内没有水的原因导致细胞生长过慢的经历。

• xingyi08 (2012-5-16 12:45:15)

  孵育箱是刚加的去离子水啊，温度是37°C，CO2浓度是5%。
  今天又看了一下，已经有活细胞贴壁了，但是非常之少啊，而且10倍镜下还是有圆圆的、胖胖的、很小的东西，本来以为是细胞，但是比较了一下，比正常贴壁的细胞要小，有人说是细胞内容物，有人说是细菌感染，可能是白色念珠菌，10倍镜下能看清细菌吗？都已经复苏了四天了啊，郁闷

• ha111 (2012-5-16 12:47:07)

  好像一般的感染的细菌在镜下都是可以看见它的活动的。

• xingyi08 (2012-5-16 12:47:51)

  
  现在细胞已经长出来了，而且长得很好，估计可能是刚复苏的细胞长得慢吧。一开始说的圆鼓鼓的东西应该就是状态不好的细胞，细菌的话应该不会在10倍镜下看的那么清楚，而且会疯长的。

• dotaaa (2012-5-16 12:48:58)

  
  我觉得293T细胞很不好养，细胞贴壁性不是很好，且消化的度不是太好掌握，操作时动作一定要轻。如果细胞状态不好的话，考虑添加点NEAA吧。我是按照invitrogen的293FT细胞的说明书来配培养基的，细胞长的还不错，就是有的时候操作可能动作大了点，细胞就会破碎，有很多小的颗粒，有时还会动，然后我就会在显微镜下很紧张的看很久是不是污染了，搞得自己神经兮兮的。

• summerxx (2012-5-16 12:49:22)

  
  293系列的细胞基本上都是这个特性，刚复苏的时候贴壁较慢，可以在培养箱多放一天让它多贴壁。平时培养过程中贴壁较差，拍打或液体冲洗都可以使细胞脱落，所以消化时间很快，胰酶可以适当降低浓度，不要加EDTA了，基本上不要放到37度的，在操作台里面放一会就可以了，最主要的就是在培养过程中千万不要让细胞缺营养，要不然会大面积的漂浮死亡，即使救回来也会影响细胞质量，多花点时间就可以帮这株细胞养的很好，总体上我觉得还是很好养，细胞形态很漂亮，拉网状生长。