[求助]细胞免疫组化不着色的原因

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• 园丁## (2012-5-16 13:16:54)

  等等，楼主，第一，你在第二步中说，你先把爬有细胞的盖玻片用中性树粘于载玻片上了，是细胞面向下吗？如果是的话，你的一抗和二抗又滴在哪里呢，怎么能使其与细胞充分接触呢？
  第二，建议楼主不要用丙酮固定细胞，因为丙酮对细胞的损伤太大了，建议用4％的多聚甲醛，室温，30min，我们一直这样做，对细胞损害较小，效果也不错。
  下面是我们做细胞免疫组化的大致步骤，给楼主做一下参考吧：
  1、将爬有细胞的盖玻片，PBS洗3次，每次3分钟。
  2、加入4％多聚甲醛，固定10分钟，PBS洗3次。
  3、用含0.2％TritonX-100 的PBS溶液透化固定后的细胞3分钟，PBS洗涤细胞3次。
  4、在Parafilm膜上滴加5％BSA封闭液50μl，将盖玻片有细胞的一面向下盖在封闭液上，室温封闭20分钟。甩去多余液体，不洗。
  5、在Parafilm膜上加一抗，将盖玻片有细胞的一面向下盖在抗体上，置湿盒中于37℃孵箱中孵育2小时。阴性对照用PBS代替一抗。
  6、PBS洗3次, 每次5分钟。
  7、在Parafilm膜上加二抗50，将盖玻片有细胞的一面向下盖在二抗上，37℃孵育30分钟。
  8、PBS洗3次, 每次5分钟。
  9、在Parafilm膜上加SABC试剂50μl，将盖玻片有细胞的一面向下盖在其上，37℃静置20分钟。
  10、PBS洗4次, 每次5分钟。
  11、将新鲜配制的DAB试剂加入样品。镜下控制反应时间，一般在5～10分钟之间。蒸馏水漂洗数次终止反应。、
  12、显微镜下观察，照相。
  祝好运。

• caihong (2012-5-16 13:18:31)

  各位高手，我想请教一个问题，就是细胞爬片该如何保存？因为我的试剂目前还没有来到，不知该怎么办是好啊，麻烦答复一下好吗，谢谢谢谢

• TNT (2012-5-16 13:18:58)

  
  您好：
  在第二步中，我先把爬有细胞的盖玻片用中性树粘于载玻片上了，是细胞面向向上。我想咨询一下4％多聚甲醛怎么配制?我有甲醛溶液（分析纯），稀释到4%行吗？

• 园丁## (2012-5-16 13:19:18)

  呵呵，楼主
  首先，我个人认为你如果是细胞面向上的话，就没有必要先把盖玻片粘在载玻片上了，可以在染完色后，再把细胞面向下粘于载玻片上，否则你在染完色后，如果想保留片子，还要在盖玻片上再封一张盖玻片，太厚了，会影响正置显微镜的对焦。
  第二，4%的多聚甲醛不是用甲醛溶液配制的，而是用多聚甲醛（粉末）配制的，100ml双蒸水加4克多聚甲醛粉末即可，但多聚甲醛很难溶，所以建议楼主在37度水浴中过夜溶解。

• mickeylin (2012-5-16 13:19:53)

  请问Parafilm膜是个什么膜，我们实验室好像没看到用，平时我也是直接滴在盖玻片上在六孔板里做，也和楼主一样，效果不好

• 园丁## (2012-5-16 13:20:13)

  
  呵呵，所谓的Parafilm膜就是咱们常用的封口胶，用来做这个也很好用。把盖玻片倒扣在封口胶上，再放在湿盒里孵育的话，浸润较为均匀，所用试剂也较少，较果不错。我们实验室一直这样做。

• mickeylin (2012-5-16 13:20:36)

  
  那封口胶要先贴在载玻片上不，滴加试剂后再把盖玻片倒扣上，不然怎么好放在湿盒中？或是放六孔板中？还有一个问题，稀释抗体你们是用的抗体稀释液还是PBS?

• c86v (2012-5-16 13:21:16)

  各位高手，我想请教一个问题，就是细胞爬片该如何保存？？？因为我的试剂目前还没有来到，不知该怎么办是好啊，麻烦答复一下好吗，谢谢谢谢
  
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  用PBS浸泡
  然后保存于-20里面即可

• c86v (2012-5-16 13:21:45)

  那封口胶要先贴在载玻片上不，滴加试剂后再把盖玻片倒扣上，不然怎么好放在湿盒中？或是放六孔板中？还有一个问题，稀释抗体你们是用的抗体稀释液还是PBS?
  
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  稀释抗体用抗体稀释液和PBS均可

• c86v (2012-5-16 13:22:01)

  您好：
  在第二步中，我先把爬有细胞的盖玻片用中性树粘于载玻片上了，是细胞面向向上。我想咨询一下4％多聚甲醛怎么配制?我有甲醛溶液（分析纯），稀释到4%行吗？
  
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  甲醛溶液稀释10倍即可
  通用分析纯浓度为34-44%
  一比九稀释即可得到4%的甲醛溶液
  与多聚甲醛溶液是一样的
  
  另外多聚甲醛溶解在弱碱性液体中
  如PBS
  而且需要加温搅拌
  你有分析纯
  直接稀释即可

• c86v (2012-5-16 13:22:22)

  呵呵，楼主
  首先，我个人认为你如果是细胞面向上的话，就没有必要先把盖玻片粘在载玻片上了，可以在染完色后，再把细胞面向下粘于载玻片上，否则你在染完色后，如果想保留片子，还要在盖玻片上再封一张盖玻片，太厚了，会影响正置显微镜的对焦。
  第二，4%的多聚甲醛不是用甲醛溶液配制的，而是用多聚甲醛（粉末）配制的，100ml双蒸水加4克多聚甲醛粉末即可，但多聚甲醛很难溶，所以建议楼主在37度水浴中过夜溶解。
  
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  把盖玻片粘到载波片上
  是为了方便染色
  我的帖子里面有叙述

• c86v (2012-5-16 13:23:26)

  各位老师好：
  我做免疫组化做了两遍，总是不着色，一点颜色都没有，以下是我的实验步骤，请各位老师指教哪里出错了，谢谢。
  1.盖玻片置于24孔板里，爬片20小时后PBS冲洗3次各1分钟，冷冰酮固定10分钟，PBS冲洗3次，各1分钟。
  2. 取出盖玻片，中性树胶粘于载玻片上。
  3. 0.5%曲拉通孵育20分钟，PBS冲洗3次，各2分钟。
  4. 3%过氧化氢去离子水孵育10分钟。
  5. PBS冲洗3次，各2分钟。
  6. 滴加一抗50微升，4度过夜，
  7. PBS清洗标本 3次 各 5 min。
  8. 试剂Ⅰ（二抗工作液）孵育（湿盒） 37OC 30 min。
  9. PBS清洗标本 3次 各 5 min。
  15 试剂Ⅱ（湿盒） 37OC 30 min。
  16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。
  17、DAB显色。
  在显微镜下观察了10多分钟，总是不显色，不知问题出在哪了？我买的是中山金桥的PV-9000试剂盒，一抗、二抗等是工作液，已经买了一个多月了，会不会出问题？请各位老师指点迷津，谢谢。
  
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  通用步骤没有错误
  建议
  各步骤清洗时间缩短 3次各1分钟
  取消封闭
  如果还是不行
  有可能是一抗问题