[求助]关于小鼠肝星状细胞的分离

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-5-21 16:09 作者: qumm1985 来源: 分析测试百科网

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[求助]关于小鼠肝星状细胞的分离

应课题须要用到小鼠肝星状细胞，借鉴了大鼠的肝星状细胞分离方法，试了几次没有成功，有没有哪个前辈做过或正在做啊，希望指点指点

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caihong (2012-5-21 16:09:51)

说实话, HSCs 分离,其他的问题都不大, 关键在密度梯度离心这块,.
你分过大鼠的么?用的是NYCODENZ铺梯度么?

大鼠肝星状细胞的浮力密度范围在1.047-1.061g/ml左右, 分细胞的时候可以上限订的高一些, kupffer的在1.083-1.095,你可以根据这个去计算下你需要的剃度.但这只是大致的范围,具体到每个细胞来说,肝细胞也有密度小的，很多时候剃度离心下来,发现有些肝细胞也浮上来了.
所以说得率好解决,但纯度是个很头疼的问题.
肝细胞可以通过离心去除,50gX2minX2次,进本上没什么影响,有文献什么CL2MDP处理去除kupffer的,我本来也想试试,但是涉及到做脂质体,要买各种试剂,比较麻烦,也就放弃了.
至于离心力,1600G我也试过,好象是没什么影响,细胞也出来了,我还要好好考虑这个问题.
所以只好在个方面实验条件稳定的情况下,自己慢慢摸索出一个合适的梯度.
小鼠的hsc和的大鼠的浮密度肯定稍有不同,这又是两者的差别.

下面是个图,分离后48h的,种的比较稀,种了三个100mm培养皿,杂细胞很少,几乎是没有的,
但是如果用原代得,实验分组多,三个大皿的得率是不够的,

然而得率和纯度是鱼与熊掌不可兼得的,要想有6,7个皿的细胞,那么肯定是杂的.

79868245.snap.jpg
qumm1985 (2012-5-21 16:10:10)

你分的是小鼠的还是大鼠的肝星状细胞啊？我没有分离过大鼠的直接分的是小鼠的，用的是nycodenz分离液，估计还是不能参考大鼠的分离浓度，不过nycodenz好贵啊，唉经费要少，能不能提供一些经验啊，谢谢。
caihong (2012-5-21 16:11:03)

我分的是大鼠的，nycodenz用的是ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ的，基康好象有代理，他们有１００克分装的吧，估计一千块钱不到，
我用的是ＧＢＳＳ配28.7%的nyco，你开始的时候梯度可以铺的高点，容易得到细胞，再往下降，提高纯度，这些都得靠自己摸索．碰到什么问题以后ＰＭ我好了．
肝细胞离心两次去掉，影响很小。如果消化得不好,可能两次离心后还会有很多肝细胞浮上来,不过没关系,第二天就会死得浮起来,换液后就除掉了.

推荐一款比较好得分离液,ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ的OPTIPREP吧,他们有60%的储存液,而自己配的nyco每次还的在糖度仪上测浓度.
qumm1985 (2012-5-21 16:11:21)

谢谢前辈，我的课题就是要分离肝星状细胞，原代培养，以后接着做转染，我现在配的是18%的浓度，好像都是大鼠的小鼠的很少做，唉，有些东西只能慢慢摸索了
duoduo (2012-5-21 16:11:43)

具体到每个细胞来说,肝细胞也有密度小的，很多时候剃度离心下来,发现有些肝细胞也浮上来了.
所以说得率好解决,但纯度是个很头疼的问题.
肝细胞可以通过离心去除,50gX2minX2次,进本上没什么影响,

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请问，如果某些密度小的肝细胞在离心梯度的时候能够浮上来的话，即使通过低速离心也无法去除的吧？
fqswdzd (2012-5-21 16:12:02)

我要分离小鼠HSC了，用的是淋巴细胞分离液铺梯度，不知是否可用，请各位高手赐教。另外我如果用DAKO的Medimachine机械的方法得到单细胞悬液而不用酶来消化，不知是否可行？我看这种机器分出的细胞都直接染荧光做流式的。
lagua123 (2012-5-21 16:12:41)

请问，如果某些密度小的肝细胞在离心梯度的时候能够浮上来的话，即使通过低速离心也无法去除的吧？

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是不是死了的肝细胞会浮上来呢？肝细胞应该是密度很大的吧。我们离心沉淀细胞的时候一般是最下面是肝细胞，中间是红细胞（灌注没灌注干净的），最上面是淋巴细胞和非实质细胞吧。50g 的时候，只有最下面的细胞，没看到红细胞沉下来。
BUK (2012-5-21 16:12:57)

上海中医药大学肝病所是这个方面的权威,你可以问问他们.如果你联系不了,可以PM我.我可以帮你问问
cocacola (2012-5-21 16:13:29)

有人在吗，我的细胞分出来了，但长的很少，下面的试验不能继续，请教高手啊，急！