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[求助]关于人脐静脉内皮细胞的培养
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本人最近做了10几根脐带了，但是内皮细胞养的不好，存在的问题如下：
1.一根脐带消化下来的全部细胞无论接种至培养瓶还是6孔板，换液前发现细胞数量很多，全是圆形的，一个个或者数个连接一起，但是6h换液后，贴壁的细胞却很少，第二天再观察，长成梭形的细胞更少，再过2天，细胞就慢慢悬浮起来，估计是死了，不知为何？
2.我刚开始用M199培养基和Hyclone胎牛血清（20%），后来发现怎么也养不好，有老师告我pH值没有调，我于是就测了一下，果然很低，大约6.0，于是用5.6%的NaHCO3调节pH值至7.1左右。但还是不行，后来干脆换1640，还是调节pH值至7.0，发现可以生长的很好，于是现在用1640来养，另外还加入了Sigma的VEGF 4ng/ml，但是细胞还是只能生长至4-5天，胞浆内就出现一些空泡，本来是梭形的细胞形态也变的毛毛刺刺的，不太好看了，生长减缓。
请做过HUVEC培养的同志赐教：
1.一根20cm长的脐带用0.5%的胰酶10ml消化时间大约为多少？0.25%的胰酶消化时间呢？是否一定需要37度水浴？
2.一根20cm的脐带消化下来的内皮细胞大约有多少个？最好是接种至培养瓶还是6孔板？大约多少天可以长满？所有的细胞自接种到最后自然死亡最多可以生长多少天？
3.我用1640养的很好，但国外文献大多报道是M199，是否还是用1640养呢？
4.培养液中经常可以看到圆形的所谓“淋巴样细胞”，这些细胞消耗培养基，使得培养基很容易在很短的时间内变酸。请问如何控制才能最小限度的减少这类细胞的干扰？是否接种后的前3天每天换一次液（我发现这样可以最小限度的减少这类细胞的数量）
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最新回复
nn255 (2012-5-21 17:36:19)
1.一根20cm长的脐带用0.5%的胰酶10ml消化时间大约为多少？0.25%的胰酶消化时间呢？是否一定需要37度水浴？
我们实验室做原代培养的时候一直用0.25%的胰酶消化，时间控制在15-20min，0.5%的没有用过，一般消化的时候就直接扔超净台里面，没有水浴过。也有时候装在大的培养皿里放到培养箱内孵育一会。
2.一根20cm的脐带消化下来的内皮细胞大约有多少个？最好是接种至培养瓶还是6孔板？大约多少天可以长满？所有的细胞自接种到最后自然死亡最多可以生长多少天？
20cm的脐带消化下来的内皮我每次都是通过计数调节到5*10^4左右的密度接种，每次消化的结果不同，接种的数量也有差别，一般24孔板500ul能接一板。接种后24h换液，大约在接种后的2-3天以后长满。长满后就直接做实验了，没有养到自然死亡的时候，这个天数不清楚。
3.我用1640养的很好，但国外文献大多报道是M199，是否还是用1640养呢？
我们也用1640养，M199没用过，DMEM也养不好，感觉1640就可以了。
4.培养液中经常可以看到圆形的所谓“淋巴样细胞”，这些细胞消耗培养基，使得培养基很容易在很短的时间内变酸。请问如何控制才能最小限度的减少这类细胞的干扰？是否接种后的前3天每天换一次液（我发现这样可以最小限度的减少这类细胞的数量）
接种后24h换液，后面每48h换液。
any333 (2012-5-21 17:36:37)
1.按照您说的意思，20cm长的细胞大约可以收获5*10^4个/ml*500ul＝2.5*10^4个细胞，也就是2－3万个左右，这与我们的试验结果差不多。您用的是24孔板接种，因此一个孔内大约接种了1000个左右的细胞，看起来这样的密度比较稀啊！可是2－3天就长满了，我觉得很难，至少我们的细胞是没有看到这样的现象。相反，我们的细胞增殖能力在前三天还可以，但是到第四天就不行了。不知道为什么？我们还加了VEGF 的！是不是因为我们的细胞很稀？
2.您在接种前计数，但是刚消化下来的细胞中有很多的其它细胞，比如红细胞，白细胞，淋巴细胞等，难道连着这些细胞一起计数吗？这样是否不准？
3.我们一般6h后换液，也有文献24h换液的，到底哪种好呢？
谢谢！期待您的回复！
any333 (2012-5-21 17:36:56)
昨天细胞终于长出来了，主要原因还是原来接种密度太低。
看来一根脐带其实消化下来的细胞不会很多的。国外报道3根脐带才接种一瓶25cm^2的培养瓶，和我们的情况差不多，不知道imyanming 同志是如何收获这样多的细胞的？
76172760.snap.jpg
vvmmoy (2012-5-21 17:37:22)
呵呵，细胞形态不错。我们实验室一直是按我前面说的方法养的，每次取一根脐带25m^2的培养瓶至少能接两瓶。继续交流呵呵
any333 (2012-5-21 17:37:38)
any333 (2012-5-21 17:38:04)
最近右做了几根脐带，但是为何还是这样少的细胞呢？每次换液前感觉视野里密密麻麻的都是细胞，但是换液后往往细胞很少，大概就只有30%，那些被冲掉的细胞难道都不是内皮细胞还是没有贴壁的内皮细胞？百思不得其解！
我们6h换液的时候，是用PBS反复冲洗3次的，用枪头每一个地方都吹到，就是怕杂细胞太多，是不是这样的操作不对啊？
我们消化是用0.5%的胰酶消化10min，是在超净台上室温消化，是不是这样的消化效果不好，大量的内皮细胞都没有消化下来，才导致我们的细胞都很少呢？
any333 (2012-5-21 17:38:26)
知道的同志请告诉我们吧，谢谢！
eric930 (2012-5-21 17:38:54)
用ECV304替代一下得了，省的麻烦
any333 (2012-5-21 17:39:19)
QUOTE:
兄弟，ECV304现在已经不承认了，发国内的文章可能尚可，在国外也许永远发不了文章了。ATCC上也没有这个细胞株了，不信可以查查。呵呵！duoduo (2012-5-21 17:39:52)
爬片前天做好了，今天看细胞贴壁了，但是感觉细胞形态没有刚原代培养的时候好了。
我们的细胞总是养到一周左右，也就是传两代左右就出现状态不好的问题，不知道是不是因为培养条件不太适应。
有人告诉我要用专业培养基来养，不知道哪里可以买到专业培养基，买什么试剂公司的最好，又没有用过的同志请告知？谢谢！
ritou1985 (2012-5-21 17:40:10)
我养的huvec在冻存后再复苏，24小时换液还正常，但到48小时再换液时发现细胞开始成片死亡，我养在6孔板中，总是从周边向中央逐渐死亡，这是怎么回事？
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