准确定位5hmC的新方法

5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）近年来受到了广泛的关注。尽管这种碱基的确切功能仍在研究中，但普遍认为它参与了DNA去甲基化或基因表达调控。若要了解5-hmC的生物学功能，研究人员必须清楚它在基因组中的位置。为此，剑桥大学和Babraham研究所的研究人员开发出一种新技术，能定位基因组中单个位点上的5mC和5hmC。该成果于4月26日发表在《Science》在线版上。生物通 www.ebiotrade.com
5-hmC是5-mC的羟基化形式，1952年在噬菌体DNA中首次发现。几十年来，羟甲基胞嘧啶的研究一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直至近两年，研究人员才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在，可通过TET家族的酶对5-mC的氧化而产生。5hmC与5mC的关系可能影响了干细胞的分化和发育。鉴于这一重要性，确定5hmC在基因组中的定位可能对癌症、神经生物学以及生物学的其他方面有着非同寻常的意义。
亚硫酸氢盐测序是发现基因组中5mC的标准方法，但它无法区分5mC和5hmC。因此，剑桥的化学家Shankar Balasubramanian及其同事在寻找一些化学反应，希望能改变其中一个核苷酸，让它们在测序中以不同的形式读取。生物通 www.ebiotrade.com
他们采用的新方法在5hmC上添加了一个氧原子，这导致其转化成另一个修饰的核苷酸，5-甲氧基胞嘧啶（5fC）。在进入亚硫酸氢盐的测序步骤时，这种新的核苷酸转化成尿嘧啶。而额外的氧化步骤对5mC无影响，这样研究人员就能区分基因组中这两种核苷酸。
为了检验氧化反应是否只针对5hmC，研究人员将三条合成的双链DNA（包含胞嘧啶C、5mC或5hmC）暴露在高钌酸钾（KRuO4）中，之后开展亚硫酸氢盐测序。实验表明，5mC和胞嘧啶未转化成尿嘧啶，而5hmC确实转化成尿嘧啶。生物通 www.ebiotrade.com
之后，研究小组利用氧化过程来靶定小鼠胚胎干细胞的基因组DNA中的5hmC。利用氧化和亚硫酸氢盐测序过程，他们高度精确地定位了5hmC。将此结果与标准亚硫酸氢盐测序的数据进行比较，研究人员确定了5hmC和5mC的精确位置。
Balasubramanian认为：“这是首个以单碱基分辨率对5hmC和5mC进行定量测序的方法。此方法相当简单，操作简便，并与所有测序平台兼容。倘若是全基因组测序，主要的成本仍然是测序。”生物通 www.ebiotrade.com
去年，美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作，曾利用第三代单分子测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。借助PacBio RS测序仪，研究人员可直接检测DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。