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[求助]3T3-L1细胞总是卷！
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我是新手，最近刚刚开始养3T3-L1细胞，接连出现问题！这些天出现的问题是：
细胞在培养瓶中生长一切正常，接种到6孔板或是24孔板之后，当天一切正常，可是第二天或是第三天换液时，问题出现了：刚刚换完液之后，细胞就卷了，而且卷得非常厉害，非常快，肉眼就能看到，缩成一小片。培基是37度水浴温热过的呀。
然后就开始找原因，一开始以为是细胞接种密度太大，长得太多，于是就调整密度，调整换液时间，可是照旧卷！然后就怀疑是不是培基的事，果然，换了别人的培基，至少就不卷了。可是，我的培基为什么会有问题呀？
我配置培基的方法：
1. 1包Gibco的DMEM，1.85gNaHCO3，2.38gHEPES，一起加入1L三角瓶。
2. 加入900ml超纯水（18.2兆欧，新鲜）。
3. 加入双抗。
4. 定容至1L。
5. 无菌过滤。
6. 4度保存。
PS：培养箱是5%CO2。
我的疑问如下：
1. 上述的配置方案有何不对？
2. 保存时间：这样配好的培基多长时间内用完？感觉我的培基在20d左右颜色就偏紫了，我上述说细胞卷了，培基25d左右了，是不是因为时间太长了？大家一般用多长时间？4度保存的话，园子里有的战友说得2星期之内用完，有的说1-2月没事。到底怎么判断？颜色？
3. 需不需要调pH？有战友说得调，有的战友说没有必要，到底要不要？
4. 细胞卷除了我怀疑的培基的事，还有没有其它原因，有啥方法可以避免？
5. 上面说换人家的培基没事，人家是买现成的用，大家也是吗？那家的比较质量可靠，还不是很贵？
新手一个，还没上路就摔倒好几次，真的很着急，因为我得负责把这一块传承下去，可是迟迟不能上手，大家帮我分析一下吧，谢谢大家！
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最新回复
131415 (2012-5-24 13:51:59)
培养基4度保存1到2个月没有关系，但是培养基内的CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基颜色也会随碱性增加而更偏暗红。细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能产生脱壁现象。
我养3T3-L1几个月了，一直用的都是hyclone的现成的高糖培养基，都没有出现过问题。就是这两天出现你说的这种问题了，最后细胞聚集成岛状。不是污染，没有染菌的症状。第一次发现时细胞有脱壁现象，本来以为会脱壁死亡，想了想又放培养箱中过夜看看情况。结果第二天观察细胞并没有死亡，重新贴壁了，只是不均匀了。所以我怀疑可能是培养基ph的问题。
131415 (2012-5-24 13:52:19)
呃，刚看到，一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素，应该在两到三周内使用。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
不过一般使用时间差不多就是两三周的样子，所以之前也没有注意过这个问题，有经验的战友可以说说看法啊。
vivian4123 (2012-5-24 13:52:39)
那你是怎么解决的？重新换了新的培基？ 有没有可能是细胞状态本身就不好？因为我听别人说他自己配的培基，2个月都没事，也是3T3-L1。
131415 (2012-5-24 13:52:59)
还在找原因，也很头疼。昨晚一个六孔板上的其中一孔细胞也开始出现你说的从外向里卷了，还有一个板上的大片的细胞没有贴壁。之前分盘以后都长得挺好。师姐看了以后说以前也出现过，是在代数比较老的情况下。但是我以前养过十多代的也都没有出现问题啊，郁闷。
如果说是培养基的问题，那之前同一瓶培养基养的也挺好的。现在排除了污染，还有操作的原因，推测可能是培养箱的温度太高了，因为这几周培养箱的温度一直在38度以上，今天刚把温度调了，还有几盘细胞，准备再养养试试看。
咱们随时交流阿。
owanaka (2012-5-24 13:53:19)
你的培养基配方是不是有问题啊，我怀疑是渗透压的问题。
1，我用的是Gibco的DMEM(high glucose), 配的时候只需要加3.7gNaHCO3，调Ph到7.4左右，过滤即可。
2，双抗要用的时候再加。
vivian4123 (2012-5-24 13:53:54)
现在严重怀疑是细胞状态的事，因为我的细胞实在长的太快了，听别人说3T3-L1应该不会长这么快的；而且这个细胞只能在非常新鲜培基的条件下才不卷。大家说，细胞状态是不是有问题呀？
头疼！
misswu61 (2012-5-24 13:54:21)
细胞怎么会卷呢
我严重怀疑你的细胞是长太满死了
vivian4123 (2012-5-24 13:54:44)
8princess8 (2012-5-24 14:48:08)
vivian4123 (2012-5-24 14:48:32)
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