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[讨论帖]用RPMI1640的朋友们做个试验吧！
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不知道大家有没有用1640做过MTT的实验呢？
我发现加100ul的1640后，再加入20ul的MTT在培养箱中孵育3-4小时只是颜色稍微有点变深了，镜下没有变化。可是如果孵育12小时，肉眼就会看见有悬浮的蓝色颗粒，镜下会有很多黑色点点，还有很多结晶出现，（只是单纯的培养基，加过碳酸氢钠和双抗，没有血清和细胞）。而其他的培养基没有这种情况，而我刚配的和我师姐配的1640都有这种情况。似乎是污染了！
我觉得用这种方法能很快判断出你的1640是不是污染了，有很多朋友只是将新配好的培养基放到培养箱里，看它变不变浑浊，可是发现即使不变浑浊，
还是污染了，而加入MTT后很快就能看见效果！
大家来试试吧，看看你的1640怎么样！
记得要把结果发出来啊！
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最新回复
qqq111 (2012-5-25 17:10:28)
qqq111 (2012-5-25 17:10:56)
66小飞侠 (2012-5-25 17:11:21)
我的也是那个牌子！我也是在用MTT做活性时发现这个问题的，往往空白组和加了细胞的颜色几乎一样，所以我特意单独用培养基和血清做了实验，发现培养基有问题，不知道是污染还是怎么回事，居然有结晶！
楼上是不是只是把培养基单独放在培养箱里培养啊？这样是不会看出污染的。
期待大家的发言！
qqq111 (2012-5-25 17:13:07)
在培养瓶和96孔板都培养过，瓶里培养液没什么变化，板上不加细胞和加细胞的OD是几乎一样的。我昨天做上对比了，两种培养基各分三组，一组是10%灭活血清加培养液，一组是只有培养液，另一组是10%没灭活血清加培养基，各做两列，用96孔板做的。今天加MTT,我打算明天扫描，我模拟我们其中的品种的做法做的。楼上战友不知你加裂解液没有，我准备加MTT4小时后加裂解液，与你做的是否相同？，
windy+++ (2012-5-25 17:13:29)
我用酸化的SDS和DMSO都溶过，它们都能将培养基产生的结晶和颗粒溶掉，溶液呈蓝色或紫红色。
不知你在镜下看没看过空白组？
“板上不加细胞和加细胞的OD是几乎一样的”是不是在加入MTT之后的颜色呢？还是只是单纯培养？我不知道你是不是加入MTT孵育4小时候发现空白组也有颜色变化！
继续讨论！
qqq111 (2012-5-25 17:13:59)
对，就是溶解结晶的。我用的是15%SDS，50%DMF,用盐酸调到4.7以下，溶解孵育后呈溶液紫红色的。加细胞和不加细胞几乎一样是指OD值。我昨天下午4：00做的对比孵育到今天上午，加的MTT孵育约四各个小时后，发现加有血清的培养液有紫色结晶，明显比没加血清的单纯培养液要深，而且单纯1640加过MTT孵育四小时后发现是黄绿色。而同时在一个板上做的DMEM显示正常。
911 (2012-5-25 17:14:19)
呵呵,终于看到有人跟我一样的结果了!我也找不到答案哩
guagua (2012-5-25 17:20:16)
真是奇怪了，那些发表了的文献都是怎么做的呢？
大家快发言吧，到底怎么回事？
guagua (2012-5-25 17:21:29)
哦，对了，你把那个只有1640和MTT的多培养一段时间，最好过夜。明天上午在镜下看看情况吧！
等你的消息！
qqq111 (2012-5-25 17:21:51)
kswl870 (2012-5-25 17:28:12)
用不同PH的单独的1640或加血清的1640分别加入MTT
发现颜色是不同的 PH值约大 颜色越深
而DMEM的这种现象并不明显
但不管怎样
从我开始做MTT到现在也有几年了 还从没看到过没有细胞也会有结晶的现象
所以我觉得你们的培养基是不是污染了
MTT是一种颜料 应该是没有那个酶是不可能染出结晶的
另外我还想顺便说一个问题：
bjzhaohong3说的OD值 1640比DMEM大很多
这可能与1640极容易在变碱性有关
因为我做过很多次的比较 1640 DMEM的差异有 但从没有过这么大
总之我的经验教训是：
如果1640中加细胞和不加细胞最终结果差别不大可能有两种原因
1、培养基污染
2、PH值有问题
说来惭愧
近实验室好几年了
toy (2012-5-25 17:46:11)
上午把培养基测了一下PH值，前天做对比实验的1640为7.65，DMEM为7.7，看来稍微偏碱一些。昨天对对比实验的本实验室1640为7.65，别的实验室DMEM为7.30.今天加MTT后培养2个小时后发现本实验室的1640加有血清颜色变深，别人的显示正常，为黄色。
windy+++ (2012-5-25 17:46:45)
你说“从我开始做MTT到现在也有几年了 还从没看到过没有细胞也会有结晶的现象”，你是加入MTT几个小时后观察的？有没有12个小时之后观察过呢？
我孵育四个小时后，也只是颜色有点变化，没有结晶和颗粒，出现颗粒和结晶是在过夜之后的事，不知道你观察过没！
的确不排除污染的情况，可为什么，同等条件下其他品种的培养基没有这种情况？
还有我的培养基PH在7.2-7.3之间，颜色是橘红色，绝对没有偏碱。
04906 (2012-5-25 17:47:11)
我最多做过8个小时
kuaizige (2012-5-25 17:47:34)
我也做过类似的试验，只孵育4小时，不加细胞的孔只加完全培养基的值很小，几乎和空白的孔一样，用的培养基是Gibco1640培养基
guagua (2012-5-25 17:50:28)
loli (2012-5-25 17:51:04)
MTT进入微生物的线粒体里面了，可以这样理解吗
很巧妙的验证方法
join (2012-5-25 17:51:23)
有的菌（姑且先这么说吧，还有支原体等）是寄生性的，培养不长，但是会繁殖，不过于一般试验无太大影响，可以视为系统误差，lz可以细胞培养后光镜下观察，如果影响实验，建议用排除法，怀疑视什么微生物，可以购买诊断试剂，确认后再加药杀灭，呵呵，一般卖的大牌子培养基不会有问题的，毕竟做生意的嘛，我们实验室曾经怀疑血清有菌，折腾了半天，换了几个牌子，我觉得不同试剂的差异对施压影响更大。
mamamiya (2012-5-25 17:54:49)
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