[求助]人脐静脉内皮细胞分离、原代培养

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-5-29 12:02 作者: ququer787 来源: 分析测试百科网

最近我们一直在做HUVEC的原代培养，摸索了几次，一直都不稳定。恳请各位战友指点！！！

取健康产妇脐带，D-hangk‘s冲洗静脉内腔和外表面，0.1％胶原酶（sigma）+0.25％胰蛋白酶（0.02％ EDTA），1:1配对消化。其中一次37°C消化约40分钟，细胞形态较为典型（附图），第2天就贴壁良好，第4天作第一次传代（接种密度比较高）。但后来再次摸索，消化下来的细胞很多都呈淋巴样细胞，和消化40分钟的那一次形态差异显著。后来我们消化时间从5 min、7 min、10 min、15 min一直到50 min都有摸索，单独胶原酶消化也曾试过，效果都不满意。

欢迎各位战友指点、讨论！！！

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ququer787 (2012-5-29 12:05:28)

上面一张图片是脐静脉分离当天（第1天）的成像。。

下一张为培养第3天的成像。

49756886.jpg
cj_mondy (2012-5-29 12:05:47)

细胞的形态不是很像内皮，你可以把培养的时间再延长，看会不会长出成纤维状的细胞，我怀疑你这样消化下来的不是内皮了。
为什么用胶原酶呢？一般分离间充质细胞会用到。
分离内皮细胞直接用1%胰酶37度20分钟就可以了，你的时间也太长了。
还有培养基也很关键，你还可以增加一些细胞生长因子进去，这样比较容易得到。
祝你成功
ququer787 (2012-5-29 12:06:10)

我们参考了国外的一些文献，大都用胶原酶或胶原酶联合胰蛋白酶。
我们的课题主要是关于血管内皮方面的，所以先取脐静脉内皮摸索的。
单独用胶原酶消化很多细胞黏连，联合消化要好很多。1%的胰蛋白酶消化，浓度会不会过高呢？另外是否需同时添加EDTA呢？

如果有战友也在做HUVEC，还恳请上传几张分离当天的细胞形态供谈论一下！
duoduo (2012-5-29 12:06:36)

楼主的照片从形态学上看应该内皮细胞，成纤维细胞不象这个样子，楼主37度40分钟确实有点长了，如果真是这样，细胞早就死了。我们是室温下消化约30分钟得到的细胞，下图是我们长成单层的细胞（可惜没有鉴定）。

23732956.snap.jpg
is2011 (2012-5-29 12:07:00)

得到的HUVEC应该用哪些指标鉴定其为真的HUVEC呢？
fklo83 (2012-5-29 12:08:49)

我是用0.1%胶原酶I消化大约30分钟，分离得到HUVEC。可以通过检测一种蛋白或因子的表达就可鉴定了，好像是第八因子啊什么的，具体不记得了，几年前做过的了，但很多文献都有，包括中文文献都很容易查到。需要购买一种抗体进行免疫组化鉴定。
vera+ (2012-5-29 12:09:15)

根据脐带长度不同消化的时间会有所不同，我们做的时候30cm的脐带用0.25％胰蛋白酶室温消化20-30min，分离得到的HUVEC可以用八因子鉴定。
vera+ (2012-5-29 12:09:35)

补充一句：脐静脉消化好后会显得很透亮，消化过程中可以上下滚动胰酶使其与血管内皮充分作用。
00无名指00 (2012-5-29 12:10:00)

Incubate in 0.1% Type I collagease at 37℃ for 10 min