[求助]细胞转染

最新回复

• qumm1985 (2012-5-29 16:13:29)

  
  瞬时转染：指将质粒或是其它的什么片段转染到细胞中，因为细胞会分裂，质粒等会不断的被稀释，同时细胞中的一些酶类也会降解这些东西，使得其在细胞中的作用不能持久，象质粒转染到细胞中之后，一般能持续表达你的目标基因7天左右；
  稳定转染：指将质粒或是病毒载体等转染到细胞中，通过筛选标记的筛选，可以将那些质粒或病毒基因稳定整合到染色体中的细胞筛选出来，这种细胞可以持久稳定的表达你的目标基因，并可以传代培养，因此称为稳定转染。

• bananapeople (2012-5-29 16:13:46)

  
  请问你有稳定转染筛选的方法步骤吗？

• 彼岸花opp (2012-5-29 16:14:12)

  对不起,我还没有成熟的筛选方法!

• duoduo (2012-5-29 16:24:23)

  
  你好,我想请教个问题,稳定转染的基因整合到基因组,这种整合稳定吗?我也做稳定转染,可是我的克隆很不稳定,不知道是因为克隆不纯还是因为整合的不稳定?谢谢!

• caihong (2012-5-29 16:29:51)

  稳定转染细胞需要用筛选的药物如G418，潮霉素等（系转染的质粒所带）按一定浓度加入转染的细胞中共培养一段时间，一般两周到一个月，药物浓度根据细胞可以调整，一般需要先作预实验确定药物浓度，要求是一周左右杀死所有未转染的细胞。在转染后筛稳定株时需要加一个未转染的细胞作为对照，当药物把所有对照细胞全部杀死而转染的细胞仍能存活，再培养一到两周就可以算是筛出了多克隆的稳定株，但这时的细胞并不好，你需要挑单克隆，找出目的蛋白表达最好的细胞来，一般我是用96孔板种50个左右的细胞，以加药的培养基培养，最后得到多个单克隆，再转到六孔板，再传至细胞培养瓶，以Western或免疫荧光鉴定，选出最好的克隆使用，整个过程得1-3个月，如果你的目的基因抑制细胞增殖或促进细胞凋亡，那你多半筛不出稳定株。

• vvmmoy (2012-5-29 16:30:14)

  我是新手。弱弱的问个问题，我转进去质粒但是不知道成功与否，因为质粒上没有编码例如绿色荧光蛋白的序列，是不是只能后期做Western或PCR检测？怎样可以快速得知我的质粒有没有成功转染呢？

• chuntian1983 (2012-5-29 16:31:03)

  你的质粒不含荧光蛋白序列，应该含抗性基因的吧，可以通过筛选了解是否转染成功，挑取单克隆以后，可以通过RT-PCR和Western了解其在mRNA和蛋白水平的表达情况。

• 彼岸花opp (2012-5-29 16:31:25)

  是啊，有抗性基因的，但是觉得这样太慢了，不像荧光蛋白可以随时观察。我想试着把编码GFP的序列插入我的表达载体，不知道可不可行。

• gogo (2012-5-29 16:31:48)

  
  各位高手，我用的是脂质体转染鼠的原代细胞，现在按照操作说明24孔板每孔加2μl脂质体，可转染后6小时给细胞换成含血清的培养液时，显微镜下观察细胞状态就已经非常差了，转然后24小时观察转染效率，几乎没有效率，倒置显微镜发现细胞除了死的就是裂解的，在孔板底部可见很多小碎片，这是脂质体对细胞的毒性吗？还是我的细胞对脂质体的毒性耐受力太差呢，不知道如果病毒载体转染的话对细胞会不会有毒性呢？现在非常急切，实验已经做不下去了，转染不成功没有细胞，下面的实验继续不下去，请各位高手指点迷津啊，谢谢啦！！

• zzzz (2012-5-29 16:33:17)

  
  我也正在做稳转，转的是K562细胞，G418筛选，我都三天换一次液，但是每次换液后，原来的活细胞就会死很多，现在已经到十几天了，换了三次液 ，也基本上没有活细胞了
  有谁曾做过阿？能不能告诉我是怎么回事？转然后一直不换液行吗？我都快要被它逼疯了

• xevin (2012-5-29 16:33:33)

  
  换液同时也弃去细胞自身分泌培养液中的生长因子等，转染后的细胞本身就很脆弱，建议用条件培养基来培养较好，含生长因子．

• 2541 (2012-5-29 16:33:52)

  
  条件培养基要如何制备呢？而且怎么冻存的，可以放-20度吗？

• redbutterfly (2012-5-29 16:34:11)

  或者你可以考虑将细胞上清过滤与新鲜培养基混合使用，减少环境改变对细胞的影响。要注意的是，上清中虽含有生长因子但也有不少代谢产物，比例不要太大。按比例<或等于1：1