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[求助]细胞培养的若干问题
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我是细胞培养新手，培养中有若干问题向各位高手请教：
1.配好的1640培养液为什么放置一段时间后pH会变碱？
2.对于悬浮细胞来说换液应该采用全量换液（离心后弃去所用原来培养液，加入全新的培养液）还是半量换液（离心后弃去一半原来培养液，加入一半新的培养液）？何者更有利于细胞的生长？why？
3.对于悬浮细胞来说（如K562），如果接种密度过小（<100000/ml）在加上全量换液对细胞生长会有什么影响？
请各位高手不吝赐教！谢谢
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最新回复
Ao7 (2012-5-29 17:41:08)
2.我们实验室养的细胞，NB4等如果不是培养基太紧张，一般都是全量换液，这样子养分比较充足，而且可以减少细胞生长过程中排泄的废物对细胞造成的伤害，对细胞生长比较好，一般这样子培养的细胞生长的状况要好过半量换液的；是不是有一些细胞比较特殊，需要半量换液的就不太清楚了。
3.我们养的悬浮的细胞如CEM等如果密度过小，再加上全量换液，细胞可能会死掉
october7 (2012-5-29 17:41:27)
尝试回答你的问题,也请各位战友指正:
1.我用的是sigma公司的1640粉装培养基.我们知道其中有加入2.0gNaHCO3(最好优级纯)的一步来校正PH值,所以在你最后用PH计校好的培养液中就有大量HCO3-离子,而它是不稳定的,即使在4度放置,长时间也容易转变成CO2气体逸出,使培养基PH值发生变化,从而颜色偏碱.不过有解决的方法,那就是配好滤过菌后用Parafilm封口膜小心封好,这样可以长期(>3月)在4度放置也基本不会变碱.或用CO2气体再次校正PH值.
2.悬浮细胞如你所使用的K562,换液传代的标准方法是将换液前培养液用吸管吹打混匀,然后记数,再取足够数目的细胞加入新培养瓶中,补足新鲜培养基.对生长缓慢的细胞系需要达到终浓度为1*100000/ml,生长迅速的细胞系也要达到2*10000/ml.但是在实际操作中可以这样做,那就是半量换液,白血病细胞系的生存活性还是很强的.所以你可以将换液前的培养液(以10ml为例)用吸管吹匀后,记数并弃去约8ml,再补足培养基至10ml.3~4天换液一次(可以在操作很好的情况下连续使用培养瓶传代,1月换一次),这样细胞的状态就非常稳定的.白血病细胞系的全量换液一般只在冻存和复苏细胞时采用.
3.悬浮细胞传代的细胞数过小（<1*10000/ml）,并采用全换液,会导致细胞生长停滞.采取的补救方法是用高胎牛血清浓度(15%~20%)的培养基全换液培养.
我培养的白血病细胞系有Kasumi-1(18%胎牛血清), K562(10%), NB4(10%), HL-60(10%),其中除Kasumi-1细胞系要求较高外,在标准无菌操作情况下,其他的都是很好养的.
祝你实验顺利,有问题再交流.0票
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yonger (2012-5-29 17:41:43)
谢谢高手赐教！我养的一批细胞（K562）由于接种密度小并且全换液已经挂了。今天终于知道原因了！非常感谢！
yonger (2012-5-29 17:42:11)
我还想请教一个关于1640培养基配置的问题，我用的是Gibco公司的培养基，再配置过程中按配方加入2.4gNaHCO3，然后由于调pH值的原因又额外加入2g左右的NaHCO3才是pH调倒7.2－7.4（用的是pH试纸，所以比较粗略）。但是发现细胞一直长不好（K562呈现7～8或十几个一团的飘在培养液中），而且培养基在四度冰箱里的颜色是正常的，但在培养箱里放一夜的话颜色明显偏红（pH偏碱），排除培养箱CO2浓度偏低和培养瓶盖子过紧的导致的可能性，请问我细胞长不好是不是由于1640配置过程导致的pH问题？请高手解答！
glass (2012-5-29 17:43:02)
QUOTE:
根据我的经验,一般的1640培养基按公司的配制方法配好后是基本不需要再加那么多的NaHCO3的.基本会比较接近PH7.1~7.4.差距大约只有0.2左右.调制PH值我用的是电子PH计(精度0.01),根据你说的我觉得可能是:
1.你要保证pH试纸的质量,是否在保期,是否变潮.
2.你现在配制的培养基肯定是偏碱性.建议能借用别单位的电子PH计确认.PH值偏差太多一定不利于细胞生长.（K562呈现7～8或十几个一团的飘在培养液中）,我培养的K562细胞状态很好,应该是散布的,干净透亮.外表圆润.
3.无菌标准操作一样很重要,确保配制的培养基滤菌的效果.双抗在新手来说还是有必要加的.
有问题继续交流.
yonger (2012-5-29 17:43:21)
yonger (2012-5-29 17:43:56)
(1) 1640培养基 : 血清 : DMSO=5:4:1
(2) 血清 : DMSO=9:1
请问高手冻存液的配方应该是前者还是后者更有利于细胞活力的保持？各有何优缺点？（前者便宜是显而易见的)
2. 细胞冻存的终密度以多少合适？
3. 细胞冻存管就是普通的EP管吧？
dongdongqiang (2012-5-29 17:44:14)
我冻存的是悬浮细胞,按我的做法回答你,仅仅代表个人观点:
1.我用含20%的胎牛血清的1640培养基,DMSO占10%.即2ml的冻存液中含200ulDMSO.
2.很少听说用那么高浓度的血清做冻存液的.
3.我的冻存浓度为2 *10E6其实1*10E6~1*10E7均可.对于较脆弱的细胞需要适当
增加细胞密度.以利于复苏后快速存活.
4.细胞冻存管是特制的专门用于冻存.我用的是cornning公司的.效果很好.一般使用玻璃冻存管需注意密封好,但是适合长期冻存.普通EP管肯定不行的,不能耐受液氮.
关于细胞冻存,园内很多帖,搜索一下就会有很多收获的.
tianmei001 (2012-5-29 17:44:31)
我配1640时候，直接将Gibic公司的一包粉剂融到1L三蒸水 ，再加10%的小牛血清，过滤除菌就可以使用了。培养的淋巴细胞，长的还可以呀，给大家一幅图看看：大概5乘10的六次方。
tianmei001 (2012-5-29 17:44:47)
图如下：
36878678.jpg
yonger (2012-5-29 17:45:06)
请问高手用来配置冻存液的DMSO（由于已经开封用来做过MTT了，我怕有细菌污染）可以用滤器过滤吗？
lagua123 (2012-5-29 17:45:22)
我看有资料说，DMSO本身就有灭菌作用，不用高压，高压反而会破坏结构，但有的又说 DMSO高压，我也很想知道用不用灭菌
hustwb (2012-5-29 17:45:38)
hustwb (2012-5-29 17:46:21)
哪位有HL-60细胞嘛？不知道可不可以赠送一些给我，有K560，jurkat细胞可以交换。我在广州。
yonger (2012-5-29 17:46:47)
tianmei001 (2012-5-29 17:47:09)
可以选用公司买的一次性滤器，选择尼龙膜的滤膜。
tianmei001 (2012-5-29 17:47:27)
可以选用公司买的一次性滤器，选择尼龙膜的滤膜。
idea2011 (2012-5-29 17:47:51)
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一般3个进口的一次性滤器可以滤1L的培养基，
我曾只用了两个。是MINIPORE的牌子的滤器。
yonger (2012-5-29 17:48:11)
请问DMEM和1640的主要区别是什么？白血病细胞系K562可以用10％胎牛血清的DMEM培养基暂时养一段时间吗？
october7 (2012-5-29 17:48:35)
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呵呵,干冰运输可保证质量,接近零下八十度,很好的!
祝实验顺利
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