[求助]大家看看我的293细胞状态怎样？ 适合转染吗？

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• 33号 (2012-5-30 10:37:59)

  
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• 33号 (2012-5-30 10:38:22)

  
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• 33号 (2012-5-30 10:46:32)

  
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• owanaka (2012-5-30 10:49:20)

  
  不太好 至少你的细胞长的太不均匀了
  而且有的细胞已经老化 消化的问题

• glass (2012-5-30 10:50:22)

  
  我的细胞是师兄冻存的，也不知多少代了，我用的是0.025的胰酶＋EDTA消化的，而且尽量吹打均匀，可接种后仍然长的不均匀，呈片状生长。我试的转染了，效率不高，还能不能用来转染做表达啊？ 望各位指点

• loli (2012-5-30 10:50:41)

  
  你怎么评价转染效率的那？效率大概多少？

• 33号 (2012-5-30 10:50:57)

  
  我是通过大致估计细胞数来计算的,即荧光显微镜下细胞数与总的细胞数之比计算的，转染率约10％，质粒是去内毒素提的，浓度约1.0ug/ul,转染试剂是lipofectmin2000,想再试一次，细胞是师兄留下的，也不知几代了，想看看是不是细胞的原因。

• hot_hot_hot (2012-5-30 10:51:14)

  首先你一定要明确代数，这一点很重要。转染的时候用低代的293细胞转染效率高。如果转染效率低，首先你就应该考虑293的代数太高了。我用腺病毒转低代的293细胞（第40代左右），转染效率几乎100%，用质粒转染293细胞的时候，转染效率至少20%。
  另外，293细胞挺好养的，它贴壁很不牢，消化的时候我都是用自己配的大约0.125%的胰酶，不加EDTA，有时候发现胰酶不够了，干脆啥都不用，直接吹打就消化下来了。如果用EDTA，消化太快，很容易消化过头，消化太厉害也损伤细胞，影响细胞的活力。

• 小螺号 (2012-5-30 10:51:33)

  请问大家做转染时，都是怎样处理质粒的阿？即对质粒的浓度，纯度有什么要求吗？最重要的，需要过滤除菌吗？

• eric930 (2012-5-30 10:51:51)

  
  质粒没什么特别要求，如果你有去内毒素的质粒试剂盒可以考虑用它，如果没有就用一般的试剂盒效果也不错，我们实验室用的是TaKaRa,Qiagen质粒提取试剂盒。一般小提试剂盒提出的质粒浓度是0.35 ug/ul （需要电泳或分光光度仪上测定），纯度要求是OD260/280>1.8，转染前质粒不需要过滤除菌，不过值得注意的是转染用质粒需要用DDW溶解。

• 小螺号 (2012-5-30 10:52:11)

  我是用手提的，没用Kit，请问，DDW是指去离子水吗？

• eric930 (2012-5-30 10:52:29)

  
  你的293细胞状态不太好，实际上293细胞很好养，你不应该用这种状态的细胞。可以再问别人要一株状态好的。293细胞用腺病毒做转染效率很高，MOI=100的时候，转染效率可以达到90%以上。

• baidukk (2012-5-30 10:53:18)

  
  细胞状态不好, 应该在传代的时候调整浓度(可以先浓度大些), 让细胞能长的单层密度大些, 过几代以后再按固定比例进行传代,看是否有改善. 或者传完后,过不久 将没有贴壁的细胞弃去, 留下的可能贴壁好些.
  
  病毒是感染细胞, 不应该叫转染细胞, 有的时候可作为载体转导基因. 总之,一般不应该与质粒转染混淆.

• ladyhuahua (2012-5-30 10:53:39)

  
  293细胞的这种状态不适合做转染，转染成功与否，细胞状态很重要。我做转染时，细胞是师姐留下的，对于细胞的代数也不大清楚，开始时转染的效率很低20%，感染不成功，后来重新大题，第一次转染效率达到80%，我认为质粒也不要放太久。
  293细胞状态好了，很好养。我是用0.25%的胰酶和EDTA消化的，加上酶后不要晃动，要不然细胞会成片的脱落轻轻的放在温箱里2-3分钟，看到细胞空隙变大成沙粒状，终止消化，稍吹打即可，离心。不要消化过了，细胞虽成单个，但不容易贴壁了。

• jrwyyplt (2012-5-30 10:53:56)

  
  这个细胞状态还是很好的，看起来很健康，圆缩的死细胞很少，只是传代时没有将铺均匀而已，细胞培养代数影响转染，但我的经验这不是关键因素，起码不是首要的考虑因素，注意选取指数生长期的细胞即可，另外质粒的质量很重要，再就是转染方法的优化。供参考。

• utt0989 (2012-5-30 10:54:41)

  
  我觉得你的细胞状态不太好，我也养过293细胞，很容易消化，我用0.1%的胰酶一两分钟就消化下来，不加EDTA。还有就是转染试剂对细胞的毒性问题，你的试剂没有问题吧。我以前做转染的时候，有的细胞对它很敏感。

• jrwyyplt (2012-5-30 10:55:19)

  为什么大多数人都感觉楼上的293细胞状态不太好呢？我养293细胞有一年多了，根据我的经验，你的细胞看上去还可以啊。我用质粒和腺病毒都转过293细胞，感觉挺容易的啊。
  建议：
  1、我在转的时候，293细胞的融合程度一般在80-90%左右。感觉gdgznf2008目前细胞的融合度不够高。融合度太低或者达到100%都不利于转染。
  2、我用质粒转293时，用的QIAGEN的FILTER那种试剂盒提的质粒，感觉QIAGEN的这个试剂盒很好，提的质粒比较纯。提的质粒纯度很重要。
  3、在转染前的质粒DNA一定要用去离子水溶。
  4、适当调整质粒DNA与lipofectamine的比例。如果你提的质粒比较纯的话，就参考lipofectamine 2000的说明书操作就可以了。我当时用的60mm的培养板，质粒DNA用的8ug，lipofectamine 2000用的20ul。
  5、转染期间用无血清培养基。我用的是Opti-MEM I Reduced Serum Medium。
  供参考。

• kewanqi2011 (2012-5-30 10:55:35)

  
  细胞的形态还可以 可能是： 消化时没有吹打均匀; 也可能是传代太少了
  如果这种细胞用作转染应该还可以，仅供参考。

• summerxx (2012-5-30 10:56:00)

  
  实在很奇怪为什么那么多人说这个293的状态不好呢？根据我的经验这些细胞的状态还是很好的，但是密度太稀了，如果是这样的密度做转染肯定不行的！当然铺的均匀也是很重要的！
  293很容易转染的阿！楼主要注意转染过程的细节哦~~~~