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因为最近做实验出了些结果,也多了些新认识,
所以想把自己以前的帖子编辑下,纠正下以往偏差的认识,不想帖子已经归档了:(就另起一个贴吧
以前一直认为大鼠HSCs分离,在保证纯度非常高的基础上,充其量最大只能得到两个皿光景的量,
最近分了, 得了五个100mm皿,密度可以,纯度的话,我认为是非常高了,可以见图,分离后48H的,
老板看了,也认同细胞的纯度,但他建议,可以提高50%得率,也就是要7,8个大皿的数量,因为我实验用的是传一代细胞.
大家可以讨论 讨论.
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最新回复
qumm1985 (2012-5-30 14:42:12)
这是一张前一次拍得, 分离后七天得
92302108.snap.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:42:38)
看来版主分离HSC已经出神入化了，呵呵。我分离的HSC在24h时只有极少数开始伸展，大部分都看不出星形形态，甚至到第四天时细胞仍未完全伸展，但是版主的细胞大多数在24h就已经伸展了！我也把我的细胞贴上，请版主指教，我猜可能是分离时间太久或条件不好影响了细胞活力，或者动物太年老？另外版主的细胞得量确实令人佩服！小妹恰好要用原代HSC实验，正苦于得量不足，惭愧呀
BOSS2011 (2012-5-30 14:42:54)
31072279.snap.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:43:47)
大鼠HSC分离48h
28018990.snap.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:44:32)
13540256.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:45:21)
贴张自己52小时的照片，少的可怜啊，都是这样成局灶分布，请版主指点下那些个圆圆的还是星状细胞吗？换了两次液体，摇摇也没有洗掉。
99264021.jpg
qumm1985 (2012-5-30 14:45:55)
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不好意思,
那个是分离后两天的,我算错饿,应该是48H,
改一下,
我一般都是分离后两天换液的,这时候形态非常明显,
就象下面我画的图,
64780984.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:46:15)
呵呵，版主这样讲我就小放心一下了。就是细胞得率实在是不容乐观，还是要改进呀！
BOSS2011 (2012-5-30 14:46:52)
qumm1985 (2012-5-30 14:49:28)
今天又分了一次,感觉不是很好,结果要看明天
前前后后也分了二十多只老鼠,有些自己的认识,有不同意见大家可以参与讨论.
我认为肝脏中存在着''两种''星状细胞,
一种是以脂滴相当明显为特征的,这类细胞形态比较小,密度较低,刚分离出来的时候,与其他细胞是非常容易区别的,看一眼就认的出. 用一种非常感性的描述就是,胞浆里有小小的黑黑的东西，贴壁后很多是多边形,容易活化, 这类细胞两三天就可以伸出小脚,（如上图，600克左右老鼠，得率：5个100mm dish,24h）。
另外一种是个头比较大,在光镜下也有它自己的特征,就是周边感觉毛茸茸的,脂滴少,这类细胞密度大,与kuppfer密度重叠区域往往是这类细胞.而且这类细胞贴壁后和第一种相也有区别,大多是圆形的,也可以看到胞浆里的脂滴, 点点的，活化时间长，（如下图，红圈圈标，200克左右老鼠，得率：5个100mm dish,24h,纯度不如上图）。
我想,这是不是分别代表了肝脏里两种不同形态不同功能为主的两类星状细胞?未激活的和已激活的?
或是和老鼠的体质有关，有些大鼠HSC储存的脂滴减少了？
qumm1985 (2012-5-30 14:49:53)
放大
31157471.jpg
BOSS2011 (2012-5-30 14:52:33)
终于换了个名字，前面的名字从此就让它成为历史，因为发了一堆帖子，竟然没有1分，让同学笑话了，呵呵。
在11月24日的时候，分了一次，感觉挺好，结果也可以。终于在6天时候几乎所有的孔板的细胞（6孔板）活化了，虽然没有用Desmin去计算纯度。可惜没能抓住这“千载难逢”的机会去做实验。如今，又过去半个月了，我连续分了三次，可是再也没有那种成绩了。就连细胞的分层都没有看到，挺郁闷！好再我愈挫愈勇，尚能挺住失望的打击。
To instructorlyh ：那种圆圆的贴壁细胞，我也碰到了，就算到了传代的时候，还是照样，传代後几乎都死掉了，应该是杂细胞，但不知什么东东。
对于不同类型HSC，我感觉也可能存在，因为同一个皿的细胞，有的细胞在2天就能长成星状，拉长，而此时，有的却还在睡眠中，呈椭圆。再个证据就是有的地方分化特别快，而有的地方却很慢，这可能与这两种细胞比例有关系。
现在，我想问问各位前辈，关于细胞分层（最后梯度离心），是否每次都能看到明显的4层（含铺的一层和沉淀细胞层）？如果不能分层，最大的原因是什么呢？我的终离心梯度是11.6%，介质是nycodenz.
qumm1985 (2012-5-30 14:52:56)
如果不能分层，最大的原因是什么呢？我的终离心梯度是11.6%，介质是nycodenz.
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每次实验条件不完全一样,不能重复
Ao7 (2012-5-30 14:53:30)
哈哈，多谢版主指点！我又做了一次，终于出来了！发现消化还是挺重要的。是否消化不行，细胞量少，仍不能分层呢？
还有上次分了传代的细胞终于染上了真菌，郁闷还在延续中，“雄关漫道真如铁，如今迈步从头越”啊！
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