[讨论帖]药筛中的怪现象！

最新回复

• 969 (2012-5-30 15:06:30)

  
  是否药物浓度大了？

• youyou99 (2012-5-30 15:07:09)

  QUOTE:

  原帖由 969 于 2012-5-30 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  是否药物浓度大了？

  不是的，同一批配制的药已经做了两次了，第一次的时候一切正常。并且这个浓度范围以前都做过，没问题的。我只是做的阳性对照药，也有文献数据。浓度在正常范围。

• youyou99 (2012-5-30 15:07:26)

  目前还有一个问题，就是同样浓度的药加进去，可能这一批得到的数据正常，而下一批就不正常。比如我以抑制率为指标，会出现这一批不同加药浓度组的抑制率有明显的剂量依赖关系，而下一批可能就会出现抑制率虽然随浓度下降，但趋势不显著，低浓度组的抑制率还远远高于50％，这样我就无法进行S拟合，导致IC50的计算也不准确。不知有没有人遇到过这种情况？是如何解决的？
  
  欢迎大家来讨论药筛过程中的问题！

• youyou99 (2012-5-30 15:08:05)

  好像做这个的不多啊
  这两天仔细想了想，前后两次实验加上我同事的结果，不同的地方在于我用的细胞代次较多，是否会因为细胞传代过多导致这种现象呢？还需要实验验证。
  目前的情况是：不加药的对照测出的值相对较高，导致抑制率一直在50％以上，在进行S拟合时所有的点都分布在曲线较高的部分。难道细胞使用时间稍长后，内部基因生长会变快？但为什么一加药，药效就那么明显呢？

• youyou99 (2012-5-30 15:08:57)

  
  以前做流感病毒的拯救时，使用的MDCK细胞通常认为超过15代就不能再用。我现在还不知道现在使用的HepG2.2.15使用多少代后就必须重新复苏？而且我的细胞已经不知道多少代了，这是一个大问题！好像网上没看见有卖的

• youyou99 (2012-5-30 15:09:29)

  
  关于细胞的想法：
  
  这两天看了不少旧贴，很受启发，有一些想法。
  
  对于HepG2.2.15细胞，可能需要过一段时间就要验证一下这个细胞的活力以及HBV基因组等情况。方法为：
  1. 检测HBsAg，传代少的细胞要和传代多的一起检测，作为对照。或者检测二者的HBV DNA？？
  2. 如果传代多的细胞与传代少的细胞有明显不同，要用G418重新冲击筛选。但筛选的程度要再考量，即G418增加到什么程度才可停止？以什么为指标，DNA还是HBsAg？
  问题：
  1. 检测指标：不管是HBsAg还是HBV DNA，是否可作为鉴定指标？理论上不变或者增加才是正常，但就我目前遇到的情况来看，如果以DNA作为指标，经过长期使用后，我现在检测到DNA拷贝数增加，如何解释？因为现在感觉是细胞出问题了。
  2. G418冲击理论上也是应该起作用的。但其浓度增加到什么程度才说明细胞恢复？这个过程需要多久？
  3. G418冲击后是否需要和鉴定时相同的方法来检测以说明细胞已恢复？
  4. 细胞使用多少代后就需要这样冲击筛选？还是在感觉细胞状态不好的情况下才这样做？

• youyou99 (2012-5-30 15:09:46)

  今天的结果显示，细胞似乎没有问题，或者有问题，但并没用达到能影响我实验结果的程度。
  本来以为是细胞代次过多，导致DNA水平不佳，但今天的baseline比上次还高，但与上次只有低浓度范围和baseline高不同，今天是整体上都偏高。感觉PCR试剂不至于引起这样的变化，如果试剂批间差异这么大，那也就没什么稳定性可言了。
  但新的问题出来了：到底是什么原因是数据老是飘忽不定呢？
  今天养的细胞多加了1倍的G418进行冲击，希望数据能恢复至以前的样子。

• youyou99 (2012-5-30 15:10:28)

  
  昨天同事的结果显示，在低浓度范围，抑制率没有降下来，有连续三个浓度没有分开，都在60％～70％，导致计算的IC50较低。不过还在可接受范围内。
  等周四的结果出来再做比较。

• youyou99 (2012-5-30 15:11:12)

  
  周四结果显示，两批细胞结果尚可。一个新问题出现了：较老的细胞我铺板时有点失误导致密度比较新的细胞低很多，目测至少差1倍。但结果显示前者的拷贝数要比后者高近一倍，所有浓度的加药孔和对照孔都是这种情况。这是否说明高密度孔细胞密度过高，细胞生长至后期DNA复制不活跃甚至被抑制？从肉眼观察可见，检测前培养基已经变为黄色，说明代谢过剩导致培养基变酸；镜下观察也可见，高密度板细胞已经生长至层叠，边界无法分开。以前我用低密度细胞也取得过较好的结果，采取高铺板密度是为了缩短实验时间。因此似乎采用较低的铺板密度似乎更合适。

• youyou99 (2012-5-30 15:11:59)

  
  现在我们主要精力集中在低浓度拉米夫定处，最近实验中有1/3的机会发生低浓度反弹的现象，即最低浓度的三孔检测得出的拷贝数比其上一个较高的浓度还低，导致计算出来的抑制率反而比较高浓度处高，进行曲线拟合时，本应是一路下滑或平缓的走势，结果却成了最高一点反而高于其附近一点。
  根据我们实验来看，考虑可能是药效在低浓度处不稳定，也可以说不可靠。但领导非要拿出依据来，可愁死人！网上还没发现有类似的报道，如果有人有这方面的文献或报道，请指点一二。

• youyou99 (2012-5-30 15:12:53)

  昨天下午经过讨论，今天开始做一组对照。阳性对照药的母液最开始是用DMSO配制的，后续步骤用PBS稀释一步再用培养基稀释到工作浓度，或者直接用培养基稀释到工作浓度。计算后发现DMSO在最低浓度的药液终体积比为1：25000000，在最高浓度药液中体积比为1：1600（同事的浓度更低），我认为是不会有什么影响的，虽然DMSO可以促进HepG2.2.15中DNA的复制，但这么低的浓度怎么可能产生影响呢？但手里没有其他原因可以解释实验中产生的问题，因此，领导说按相同程序处理一下，除了阳性药之外，其他都一样，看会不会影响DNA的拷贝数。等下周一的结果来看。

• youyou99 (2012-5-30 15:13:11)

  今天的结果显示：低浓度的DMSO似乎也抑制DNA拷贝数的增加。这个大大出乎我们意料。以前曾看到一篇文献说，DMSO可以促进DNA复制的，我们当时实验结果也是一样的，但今天看来，更低的浓度似乎会起促进作用。唯一的不同在于，虽然其浓度已经低到千万分之一以下了，但和千分之一左右的浓度起的作用没什么区别，这个范围内，其作用基本是一样的，没有明显的剂量效应趋势。

• ha111 (2012-5-30 15:14:02)

  
  我做的药物浓度筛选更郁闷!本来是抑制细胞生长的,可是我用10种浓度做了4便,有3遍都是细胞生存率大于100%的甚至有160%的!!!我都不知道接下来该杂做了,希望高手帮忙!!!

• ladyhuahua (2012-5-30 15:14:38)

  
  本人也在做，但是离体肠的药筛

• HPLC使者 (2012-5-30 15:15:11)

  
  个人认为楼上要么是实验操作实验设计有问题，不然恭喜你筛出来促进细胞生长的东西了

• eric930 (2012-5-30 15:16:35)

  
  但是也有一次是比较低的啊!要说实验设计有问题也不可能啊,那是种化疗药啊哎真郁闷今天又做一批看看结果到底杂样?能否是化疗药对正常细胞没作用呢?还是有一定的时间点,过了这个时间就又变促进了呢?高手指导!!!

• youyou99 (2012-5-30 15:16:55)

  但是也有一次是比较低的啊!要说实验设计有问题也不可能啊,那是种化疗药啊哎真郁闷今天又做一批看看结果到底杂样?能否是化疗药对正常细胞没作用呢?还是有一定的时间点,过了这个时间就又变促进了呢?高手指导!!!
  
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  化疗药筛选不是用肿瘤细胞吗？？

• eric930 (2012-5-30 15:17:58)

  
  不是,我们用的是正常的内皮细胞,不是做肿瘤

• youyou99 (2012-5-30 15:18:18)

  不是,我们用的是正常的内皮细胞,不是做肿瘤
  
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  我在想，你的药将来要用于治疗什么疾病，筛选时是不是最好用该疾病模型细胞来做？用正常细胞可能不能反映药物作用。我也不太清楚，只是感觉这样会好一点，你觉得呢？

• youyou99 (2012-5-30 15:18:37)

  
  今天结果显示，含等量DMSO或等量PBS结果没有太大差别，尤其是基线数据，在完全空白对照、含DMSO（1：1600）对照、含PBS（1：16000）对照间基本没差异。是否可以认为该浓度下，DMSO、PBS对细胞/DNA复制没有影响？前面观察到的差异是系统误差和操作误差所致？