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[求助]我第一次做细胞流式，请看我的步骤对不对？
[求助]我第一次做细胞流式，请看我的步骤对不对？
我是第一次做细胞流式，是用FITC标记的二抗检测细胞表面的膜蛋白表达情况，参考了很多资料，下面是我想好的流式实验步骤，请各位看看是否合适。谢谢
一、试剂配置
1、70%乙醇：使用无菌去离子水配置，-20度冰箱保存
2、含2%血清的PBS： 将2ml的新生牛血清加入到98ml的PBS中，混合后4度保存
3、用PBS稀释一抗，二抗。
4、PBS： 按照分子克隆操作
二、操作方法
1、消化贴壁细胞----收集对数生长期的细胞1×106，用0.25%的胰酶充分消化，加入含有2%血清的PBS 2ml终止胰酶反应，1000r，5min离心。
2、乙醇固定细胞----尽量吸干上清，之后缓慢加入-20度预冷的70%的酒精4ml，边加边摇动，使细胞充分悬浮，之后4度冰箱过夜固定（约14小时）。
3、清洗残留乙醇----1000r，5min离心后吸干上清，用4ml含有2%血清的PBS重新悬浮细胞，然后再进行一次离心和重悬，以吸干残留的乙醇（第二次重悬后将细胞液一分为二，一份做阴性对照，另一份做实验）。
4、封闭细胞表面非特异性结合位点----用2ml含有2%血清的PBS重悬细胞，37度水浴30min。
5、加入一抗----1000r，5min离心后，加入2ml用PBS稀释的一抗，37度水浴30min（阴性对照只加2ml的PBS）
6、加入二抗----1000r，5min离心后，再加入2 ml的PBS稀释后的FITC标记的二抗，37度水浴30min。
7、清洗二抗----1000r，5min离心后，用PBS清洗两次
8、上机检测----用2ml PBS重悬细胞后（5*105细胞），上机检测。
敬请各位高手能给与指点，谢谢！
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最新回复
zsxan1990 (2012-5-31 11:21:09)
tieshazhang (2012-5-31 11:21:26)
1、同上，乙醇固定要求终浓度不低于70％，事实上离心时总要残留液体，所以要用较高浓度，我们用95％
2、尽量避免间接标记，影响特异性（特别楼主还用PBS代替同型对照，对结果会造成影响），此外一抗、二抗之间最适比例往往需要摸索，比较麻烦，孵育时间因抗体而异，不一定就是30min
3、本着节约抗体同时保证染色效果的目的，加抗体时，细胞悬液100ul就够了，2ml抗体太浪费了
dragonkilly (2012-5-31 11:21:49)
谢谢帮忙，不过还有一些困惑
1、楼上说的-“PBS代替同型对照，对结果会造成影响”-是什么意思啊？你们做实验是阴性对照是怎么做的啊？
2、还有就是加入抗体量的问题，我的细胞数量是10的6次方左右，您说是加入100ul的抗体量就可以了吗？
3、我的二抗是中山公司的FITC 标记的羊抗人IgG，你们在摸索二抗浓度是一般先是多少倍稀释，200倍，500倍还是1000倍啊？
4、我是检测细胞膜表面蛋白，能否直接加入一抗和二抗，而不用固定呢？这样做会有什么后果和影响？
敬请赐教。谢谢
dragonkilly (2012-5-31 11:26:06)
dragonkilly (2012-5-31 11:26:45)
我做的细胞是肝癌细胞和乳腺癌细胞。前天我用人的IgG蛋白做阴性对照，但是阴性结果却出现阳性，而我想要的阳性结果却没有出现。今天，我又重做了一次，不过和前天不一样的是我的细胞没有固定和封闭，另外，我的一抗和二抗作用的时间是1个半小时，因为我觉得我用抗体检测细胞膜蛋白，如果用FBS封闭细胞，那么有可能我的目的受体位点也被FBS封闭了，结果最后检测发现我的实验全是阴性。请问各位在检测细胞膜蛋白时用封闭 吗？封闭又有什么意义呢？
我的实验理由：不用固定，因为就是检测膜蛋白，用不着固定吧？
不用封闭，因为封闭掉的蛋白位点说不定就是自己想要的目的蛋白位点呢？
一抗和二抗作用时间长，因为等仪器，所以放长了，是在4度放的。
mamamiya (2012-5-31 11:28:06)
我只能对你的部分问题作出解答：
1.不用封闭，因为封闭掉的蛋白位点说不定就是自己想要的目的蛋白位点呢？
需要进行封闭处理。你不用担心封闭掉你想要的目的蛋白位点，因为封闭使用的是非特异的血清，它只会把非特异性结合的蛋白位点封闭掉，减少背景。而你想要的蛋白位点几乎不会受到影响。
2.一抗和二抗作用时间长？
一抗和二抗分别在4度作用1个半小时我认为不会影响你的染色结果，我们平时要是在4度作用都是过夜的，也没影响，因为温度低。但是二抗作用时你的确保让他蔽光，否则一个半小时很容易使荧光淬灭的！
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