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标题:[求助]MTT实验结果的困惑

bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]MTT实验结果的困惑


最近一直在做药物对肿瘤细胞生长增殖的影响，我用的是抗癌药多柔比星（adriamycin)做对照。用MTT法检测，但奇怪的是每次的结果都是高浓度的adriamycin（>20ug/ml)不能抑制细胞的增殖,低于这个浓度时，细胞的增殖会随着多柔比星浓度的增加而被抑制。

我的检测方法是药物作用一定时间后加入5mg/ml的MTT 10ul, 接着孵育4h后，吸去上清后加入100ul DMSO，在490nm测光吸收。

我想是不是adriamycin和MTT的溶解物在490nm的吸收有交叉啊？因为adriamycin溶液是红色的，在培养空中一段时间后，吸去上清后培养空也是红的，所以DMSO溶解后是不是也有较大吸收啊？

同时做的另外的药物结果就很好，为什么adriamycin作用效果这么不好呢？
有没有人遇到类似的问题呢？
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 我很想知道你的“高浓度的adriamycin（>20ug/ml)不能抑制细胞的增殖”
是不是就是od值过大？？？
如果是的，那么很有可能是药物颜色的影响。
2 我的结果一直都是高浓度抑制，
次于高浓度的在某一时间却可能是“促进”，
我也一直很郁闷的。
3 做一个完全是adriamycin与mtt的，看是不是也有吸收？
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kewanqi2011 于 2012-5-31 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1 我很想知道你的“高浓度的adriamycin（>20ug/ml)不能抑制细胞的增殖”
是不是就是od值过大？？？
如果是的，那么很有可能是药物颜色的影响。
2 我的结果一直都是高浓度抑制，
次于高浓度的在某一时间却可能是“促进”，
我也一 ...

1 就是od值较大，我也怀疑是药物颜色的影响，正在检测完全是adriamycin时是否有吸收。
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有可能是你所用的药物在高浓度是会对MTT有一定的还原作用所导致的，建议你在加MTT之前先将用药物处理了一定时间的培养液全部吸弃，用不含药物的新鲜培养基混合MTT一起加入，然后再按照正常操作。
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发表于 2012-5-31 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要做对照孔
每种药物浓度分别都有“种细胞组”和“未种细胞组”
用来去除药物本身的颜色影响
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superboy[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的药物颜色对吸光度有很大影响，需要做一个药物的对照孔，即培养基加药物（不加细胞），检测方法一样，最后用药物处理组吸光值减去药物对照组吸光值，而你的control 组最终要减去空白对照组（即只加培养基的孔，也叫零孔），最终抑制率=1-（药物处理组OD值-药物对照组OD值）/（control 组OD值-空白对照组OD值）。
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 小中大
你的药物颜色对吸光度有很大影响，需要做一个药物的对照孔，即培养基加药物（不加细胞），检测方法一样，最后用药物处理组吸光值减去药物对照组吸光值，而你的control 组最终要减去空白对照组（即只加培养基的孔，也叫零孔），最终抑制率=1-（药物处理组OD值-药物对照组OD值）/（control 组OD值-空白对照组OD值）。

————————————————————————————————————————————————————————————————

药物对照孔检测的时候，是加入MTT孵育后直接测吸收，还是孵育后吸去上清，加入DMSO后测吸收。两者好像吸收值差别很大，不知道该用哪个？
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以把你的高浓度的药在各个波长通道下跑一下流式，看看是不是有自发荧光。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-5-31 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如果加入MTT 之前把先前的培养基全部吸掉，再加入新鲜的培养基加入MTT的话，那么 ，被药物作用死掉的细胞有可能已经漂起来，已经漂浮在培养基中了，这样做的话是不是会使结果不准 ，偏低啊？
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bamboo16[使用道具]
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 小中大


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原帖由 leifengta 于 2012-5-31 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问如果加入MTT 之前把先前的培养基全部吸掉，再加入新鲜的培养基加入MTT的话，那么 ，被药物作用死掉的细胞有可能已经漂起来，已经漂浮在培养基中了，这样做的话是不是会使结果不准 ，偏低啊？ ...

不一定全吸出来，200ul的体系你可以吸出100，而且吸出前要离心一下。
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