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[求助]请教大家有关提取细胞蛋白做WB的事情
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我是培养细胞的新手，现在细胞状态很好，想尽快做western blot。但是存在以下问题：我要在培养的细胞中注射一种药物，观察此药物作用不同时间下我要检测的指标的变化。
我取的时间点是：注射药物后10min,30min,1h,2h,3h,4h。能否待我把各时间点的细胞都收集好了，再统一加细胞裂解液，然后测蛋白？？？（1）但是我所在实验室 的有些同学说：不可以，必须是收集完细胞后马上加裂解液，然后测蛋白，但是如果这样做的话，对于我来说，实验过程相当麻烦，6个时间点分开测蛋白的话一肯定测不完，这样肯定会对我要提取的蛋白有不良的影响；（2）有些同学说，可以先用胰酶消化细胞，然后离心，接着暂时放4度冰箱保存，带所有时间点的细胞都消化病离心完后，再同意加裂解液和测蛋白，不知这种方法可以吗？
我应该怎么做，请大家不吝赐教，不甚感激。
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最新回复
cocacola (2012-5-31 15:49:19)
第二种方法可行。
加药干预规定的时间，然后用PBS洗净，胰酶消化，收集细胞，4度保存，如果时间长就-70保存，然后一起裂解提蛋白
tie8 (2012-5-31 15:49:44)
裂解液加完后，收集液体，可保存于－20度一段时间。因为有时为了裂解完全，还要反复冻融。这样，可以得到各个时间点的蛋白都收完，再做离心和蛋白定量。希望对LZ有帮助。
+小生怕怕+ (2012-5-31 15:50:07)
加药干预规定的时间，然后用PBS洗净，胰酶消化，收集细胞，4度保存，如果时间长就-70保存，然后一起裂解提蛋白
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如果我的是磷酸化的蛋白，也能那样做吗？这样会不会对蛋白产生什么不好的影响？
+小生怕怕+ (2012-5-31 15:50:23)
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请问收集的液体是否还要经过离心才能放－20度保存?
cocacola (2012-5-31 15:50:51)
磷酸化是一个很迅速的过程，只要能保证细胞加药后发生磷酸化然后“停留”在磷酸化这个点上就可以了，不然抓不住磷酸化的瞬间就不好测了。
我做的就是磷酸化WB，我是加药后孵育10min立即用预冷PBS洗去药物，然后冰上操作裂解细胞，裂解液也是预冷的，整个过程速度要快。加了裂解液冰上吹打30min，然后4度14000转离心30min，取上清，加sample buffer煮沸10min，-70保存长时间保存，如果短期内做可以-20保存。这就是我的磷酸化蛋白处理过程，供参考。
我不是很赞同你的“反复冻融”的观点，个人认为这样蛋白容易降解。
66+77 (2012-5-31 15:51:26)
831226 (2012-5-31 15:51:46)
可以倒着加药啊，再一起收集蛋白 啊
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