[求助]G418筛选的问题

最新回复

• 8s5g (2012-6-09 12:47:21)

  
  没有做过这个载体
  不过脂质体转染的问题多半都不在转染效率，效率高不高不是很关键，关键就是能不能筛出来
  逆转录病毒转染就好筛多了

• jkobn (2012-6-09 12:47:38)

  
  GFP与目的基因并非共表达，GFP转染后大部分只是瞬时表达，筛选后鉴定还需RT-PCR,Western检测。

• laughing妹 (2012-6-09 12:48:40)

  
  可是我的目的基因是连在EGFP下游的啊，共用CMV启动子，按理说是应该共表达的吧

• pengke1983 (2012-6-09 12:49:02)

  我也建议用Western blotting鉴定一下，镜下看不到荧光不代表没有目的基因的表达，荧光应该是会越来越弱，或者开始用流式先筛一遍。

• abc816 (2012-6-09 12:49:29)

  你用的载体是什么类型的，我刚刚构建好一个逆转录病毒载体，内带目的基因和EGFP，想用来做稳定转染，PT67包装，你的载体可以稳定表达吗，我用的CLONTECH的脂质体转染试剂，你呢？

• 101010 (2012-6-09 12:50:23)

  
  这个现象很正常，原因在于质粒发生整合并且整合位置不一样，绝大多数细胞中质粒整合后目的基因的表达都没有瞬时转染的那样强烈，体现在两个方面：
  1.DNA水平：瞬时转染目的基因的拷贝数高（pEGFP－C3带有SV40复制起始点），稳定转染目的基因拷贝数低（整合位点少）。
  2.转录水平：未整合的质粒中目的基因上游的启动子组成型启动目的基因的转录，并且不受其他顺式元件的调控；整合的目的基因上游启动子容易受到整合位点侧翼序列的顺式调控（比如位置效应等），转录水平有高有低，但是高的可能性很小，因为染色体上的绝大部分区域是不具备高水平的转录活性的。
  也许你的目的蛋白在一定程度上表达了，但是表达量不足以检测到EGFP荧光的存在。

• abc816 (2012-6-09 12:50:42)

  
  你的质粒属于只能做瞬时转染的吧,怎么可能做稳定转染呢?

• 101010 (2012-6-09 12:51:34)

  pEGFP－C3是可以做稳定转染的，载体上有neo抗性基因，可用G418筛选稳定表达目的基因的单克隆。
  不明白的话，我可以把载体图谱发给你。