人源DNA聚合酶Pol δ小亚基p12的抗体制备及应用

摘要：

人源DNA聚合酶 δ (Pol δ)是由p125、 p50、 p68 和p12四个亚基组成的异源四聚体,小亚基p12在Pol δ参与DNA复制与损伤修复过程中起着至关重要的作用。为了获得具有高度特异性和灵敏性的抗p12抗体,利用PCR技术成功扩增p12基因,通过酶切、连接、转化等常规分子克隆方法构建重组原核表达质粒pGEX-5X-3-p12,经转化大肠杆菌BL21,诱导表达的可溶性融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B 柱和FPLC Mono Q柱纯化、Factor-Xa酶切,获得不带GST标签的p12蛋白作为抗原;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用Protein A/G亲和层析柱纯化多克隆抗体。经Western blot和细胞免疫荧光分析测试,所获得的抗体不但能够特异性识别细胞内源p12,而且观察到p12能够与PCNA共定位到DNA复制叉,首次在亚细胞水平上证明了p12与PCNA的粘连互作反应。高度特异和灵敏的抗p12抗体的获得为深入研究小亚基p12 如何调控Pol δ 的酶学功能、为从人类癌症发病的起因上阐明由于Pol δ功能改变而引起遗传基因组不稳定进而导致肿瘤发生的机制提供了重要的手段。