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[讨论帖]复苏L929纪录
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头一次自己培养L929细胞，手忙脚乱的，把冷冻的细胞直接放进培养基里就结束了。过了60个小时，去显微镜下看，只能看到几个帖壁细胞。仔细想想做实验的步骤，又上网查查帖子，觉得可能是没有在第二天换新培养基的问题，导致冷冻液里的DMSO影响细胞贴壁。不知道培养皿里的细胞还有没有活下去的可能。总之第一次做实验结果不好也不应该轻易放弃。
把培养皿里的上清液转移到离心管里，离心，加入新的培养基重新放到培养箱里培养，原来的培养皿除掉上清液后直接加入新的培养基，因为里面还可以看到一些贴壁的细胞。虽然数量很少。
还有几个可能的原因导致培养的不好。
1。RPMI是2年前买的，虽然一次没有用过，可是总觉得别扭。
2。把冷冻的细胞加培养基里面时，培养基忘记回温到37度了。
3。细胞在-80度的冰箱里大概有1，2年了，还活着吗？
照片是培养了60个小时的细胞。
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最新回复
zhenxin (2012-6-15 11:04:40)
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zhenxin (2012-6-15 11:04:58)
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milkdog (2012-6-15 11:05:40)
上清中的细胞活着的可能性不大.贴壁的细胞我认为还活着,不过状态不太好.你的培养基看看有没有过期,可能营养不够.
我的细胞都是冻在液氮里面,复苏的时候离心把DMSO 去掉再培养.液氮里面冻好几年都没有问题.你的在-80我没有试过,所以也不好下结论.不过有细胞贴壁说明细胞没死,至少是部分没死.
我认为可能是没有去除DMSO,对细胞有影响.还有一种说法,是说复苏的时候要把新鲜培养基缓慢加入冻的含DMSO细胞中,而不是相反,我没试过，不知道是不是这个原因.
培养基没有回温到37度没有问题,我试过从4度的冰箱里拿出来直接复苏没有问题.
建议换培养基试试,如果不行就只能重新复苏了
kswl870 (2012-6-15 11:06:02)
试试看提高血清浓度看看吧
-80度保存的确不如液氮好
不了解929，一些相对娇贵的细胞80度似乎只能保存半年到一年
zhenxin (2012-6-15 11:06:41)
今儿提高血清浓度有些难办，仅有的50ml血清被小老板用了，马上预定也要后天才到，我决定把培养基里多加些氨基酸，周四也就是明天做第三次传代，估计第四次传代的时候就可以用上增加血清的培养液了。真想和活下来的细胞握握手，发个勋章什么的
小问题？我照的照片背景是绿色的，培养基是粉红色的，我在ATCC和 Cell Bank上看到的照片是黑色的，请问有经验的战友在显微镜下给细胞照纪念照片有什么特殊的要求吗？我用的是NIKON995加转接头在显微镜下照的。
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ha111 (2012-6-15 11:07:30)
把冷冻的细胞直接放进培养基里就结束了---------------------------------------------这种复苏的方式我也用过,结果和你的差不多,贴壁的细胞很少.我也是从-70里面直接拿出来用的.
还是采用离心去处DMSO的方法比较好.短期(1-2个月左右)冻存的细胞用这种方式可行
zhenxin (2012-6-15 11:09:02)
细胞数比昨日猛增，但只是在某几个个区域，并不是在整个培养皿中，所以依旧仅仅是抽取出旧的培养基，加入新的培养基，培养基并没有什么变化，和第一次的一样。决定再继续培养24-48小时，然后做一次消化，把细胞提出来重新加培养基，可能的话就要做冷冻了。
问题
1：看到很多别的东西，有的像ZIP拉链，有的像梭子，还有一些透明的亮亮的东西。不知道是啥？准备上网找找答案，知道的战友也可以帮助说说哈。
2：照片依旧不是很理想，希望有经验的战友说说在普通显微镜下给细胞照相的窍门哈。人长得好看，没有照片也不行哈。
3:还有楼上miheshw说的对，上清中的确实都是阵亡将士。没有活下来的，一个没有
既然ATCC用黑白照片，我就用黑白吧，实际是灰度，还在在找怎么能变成黑白的方法
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zhenxin (2012-6-15 11:09:25)
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pengke1983 (2012-6-15 11:09:48)
？你是用的什么培养器皿？
我以前只用过培养瓶想，以后可能要养929细胞问下哈
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