[求助]冻存细胞解冻的问题

最新回复

• huifeng0516 (2012-6-16 15:02:50)

  我是 这样复苏细胞的：
  1、将细胞从液氮或是－80度冰箱取出，迅速将其放入37度水浴锅，使其快速融解。
  2、将融解的细胞悬液移入15ml离心管，加入3－4ml培养液，水平离心机1000rpm离心5分钟，将上清弃去，因里面含有DMSO。
  3、看细胞团块的大小估计细胞数目的多少。一般我们复苏后加4ml培养液重悬放入中盘培养。
  当然，不按上述操作，也不一定影响你的复苏。你的细胞现在这种情况：一是稀释太多，二是本来你的细胞复苏后成活率不高。悬在培养液中的细胞可能已经死的。

• 831226 (2012-6-16 15:03:37)

  
  有人说复苏细胞时离心会进一步损伤细胞，可以第二天换液时将DMSO除去，所有我跳过了这一步。你复苏一管细胞（1.5ml）接种到几个培养瓶里？我接种到2个

• junjie05 (2012-6-16 15:03:54)

  首先你要明确你的细胞是否贴壁细胞，悬浮生产的细胞肯定是悬浮状态生长的。具体的复苏步骤你可以这么做：1.细胞从液氮中取出后放入37度的水浴中尽快融化，时间最好在2分钟之内，因为在常温状态下冻存液对细胞有较大的毒性，待溶解后用吸管加入已经含有10~15ml不完全培养基的离心管中混匀后，置于台式离心机中以不超过1000转的速度离心5~8分钟取出，弃去上清液，记得不要把管底那团白色的细胞也吸走了，按上述办法再加入不完全培养基离心1~2次（目的是让DMSO去除的干净些，微量的DMSO都会对细胞生长造成障碍，你上面提到的细胞如果是贴壁生长的但复苏后不贴壁可能就是此原因导致），最终加入完全培养基进行培养，如果是贴壁细胞株6~8个小时即可开始贴壁生长，但前提是你冻存时候的细胞是生长状态就很好。

• 园丁## (2012-6-16 15:04:17)

  
  你的问题是两个：
  第一，加培养基的量，这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
  还有一个问题是我自己的经验，我感觉培养基越少细胞越容易贴附，这个道理很简单了，我就不说了，但这个问题即使有也不会太大。
  ATCC对绝大部分的细胞冻存液浓度是5％的DMSO，很多情况下，实验者易于认为DMSO加的越多细胞保存的越好，我自己做过试验却是相反的，相信ATCC吧，所以如果是你自己冻存的话，不要加过多的DMSO，在复苏时培养基也可少加一点。
  第二，离心的目的是两个，去除DMSO去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡; 此外在操作过程中容易污染，不推荐。
  你这次细胞的不贴壁的主要原因应该是冻的不好，也就是说你拿到手的就是死细胞，即使刚复苏看见会贴一部分，但由于这些细胞在冻存时已经开始不可逆凋亡，所以过两三天就全漂起来了。

• duoduo (2012-6-16 15:04:39)

  我复苏的细胞是我自己冻存的,应该不是死细胞,冻存液是10%的DMSO.
  看了各位的战友的回帖,我还有个疑问,到底要不要离心哪?

• duoduo (2012-6-16 15:04:57)

  
  对了,我实验室曾经停过一次电,时间大约18个小时,我的冻存管是放在-80度冰箱里的,不知道这个对细胞有没有影响

• baidukk (2012-6-16 16:31:54)

  
  离心有绝对的必要性。不离心你就清洗不了DMSO,清洗不干净细胞就生长不好。

• qumm1985 (2012-6-16 16:32:15)

  复苏细胞最根本的就是要在37°水浴条件下快速解冻，一般都是1ml细胞冻存液加10到15ml加血清培养液，我们这儿解冻细胞时都不离心的，细胞培养的也挺不错啊，通常都是10到12h换液的，贴壁细胞会慢慢长起来，不贴的自然淘汰。

• duoduo (2012-6-16 16:32:44)

  复苏细胞最根本的就是要在37°水浴条件下快速解冻，一般都是1ml细胞冻存液加10到15ml加血清培养液，我们这儿解冻细胞时都不离心的，细胞培养的也挺不错啊，通常都是10到12h换液的，贴壁细胞会慢慢长起来，不贴的自然淘汰。
  
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  我也是按照你的方法操作，但细胞大部分都悬浮着没有贴壁，是不是和上次的停电有关？

• HP007 (2012-6-16 16:33:13)

  冻存细胞解冻时1ml细胞液要加多少培养基？我看有人说加10ml－15ml，昨天我按此做了，今天去看，贴壁细胞很少啊，大部分还都悬浮着，我没有离心直接加培养基的。
  
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  对于贴壁细胞，我们实验室采用离心法。
  
  从液氮中取出细胞后，直接放入37度水浴融化解冻，然后将细胞悬液直接离心（800转/分），弃除冻存液，将细胞沉渣重新用培养基悬浮后，种到新的培养瓶中。效果一直很好，只要本身冻存的细胞状态好，细胞贴壁都不错的。

• 66小飞侠 (2012-6-16 16:34:07)

  
  ATCC建议的冻存细胞的复苏方法
  1．  准备一个培养容器，内装合适体积的适宜培养基，并使其温度和pH与建议的相称 。
  2．  在37℃或该细胞系正常生长温度水浴下通过轻柔摇动迅速溶解冻存管（约2分钟）；
  3．  管中内容物溶解后立刻将冻存管移到超净工作台内，并用70%酒精消毒表面防止污染，注意无菌操作。
  4．  拧开冻存管盖，将管中内容物转移到已装有少量培养液的无菌离心管中稀释，离心（一般125g，10分钟），弃去上清并用1~2ml完全培养基重新悬浮沉淀细胞，然后转移细胞悬浮液到培养容器内混合均匀。
  注意：如果冻存液中含5% DMSO，则不必离心，只需用15ml培养液悬浮即可。因为DMSO在这个浓度时没有毒性。
  5．24小时后检查培养情况，如果需要的话进行扩传。有些细胞系（比如杂交瘤细胞）从冻存状态恢复需要几天时间。实际上，一些杂交瘤细胞在第一天培养液中出现死亡细胞并产生许多细胞残骸。许多细胞冻存后活力下降并在融化后24小时到一个最低状态。此后细胞将恢复并进入对数生长期。

• u234 (2012-6-16 16:34:34)

  为什么要一分中之内,将细胞解冻?

• october7 (2012-6-16 16:35:43)

  
  解冻细胞时一定要采用快速融化的手段，不然细胞内外的水分都会很快的形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH 值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA 也是冷冻是细胞易受损伤部分，如果细胞内冰晶形成较多，冰晶体积膨胀造成DNA 的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。因此解冻时一定要快，最好在一分钟内完成，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内结晶对细胞造成损伤。

• duoduo (2012-6-16 16:36:01)

  
  最近冻存的细胞复苏后状态非常好，我想以前的失败应该和停电有关系吧，冰箱温度缓慢下降导致细胞缓慢溶解，死光啦，哈哈。
  还有个问题，一瓶冻存管复苏时可以接种到2个培养瓶中嘛？

• 我佛慈悲 (2012-6-16 16:37:14)

  一个关键问题是你的细胞在负80度冰箱放了多久，冻存细胞最好不要放在负80度。第一，负80度冰箱经常有人动，环境不稳定；第二，负80度冻存细胞不要超过半年。

• duoduo (2012-6-16 16:37:37)

  一个关键问题是你的细胞在负80度冰箱放了多久，冻存细胞最好不要放在负80度。第一，负80度冰箱经常有人动，环境不稳定；第二，负80度冻存细胞不要超过半年。
  
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  我的细胞放在－80度大概一周时间，主要是想看看冻存效果怎么样。你说的很有道理，－80度下不能放太久，不过几个月时间应该没有问题的