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[讨论帖]贴壁细胞传代-消化过程图示
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贴壁细胞传代-消化过程图示
贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为 （以下操作均按无菌操作的要求进行）：
• 将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；
• 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；
• 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；
• 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。
这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。 下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。
所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10％小牛血清的DMEM-F12，倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。
取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml培养基，同上静置培养。
经24小时培养后，生长情况为：
经48小时培养后，细胞已长成致密单层：
致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明：
弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。
加入2.5%胰酶后，细胞逐渐皱缩变圆，细胞间隙增大不再致密：
刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：
细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：
细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆：
细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：
细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：
有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。
如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。
供大家分享！
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最新回复
xevin (2012-6-19 11:20:14)
请问您的胰酶是怎么配得 ？
66小飞侠 (2012-6-19 11:21:39)
我的是称取0.25克胰酶，再称取edta，用pbs溶解至100ml。
其他的朋友是不是这么配制的？
小野花 (2012-6-19 11:22:06)
sunnyB (2012-6-19 11:23:04)
我们的胰酶也效果不好，楼主你们的那种酶哪有卖？
yes4 (2012-6-19 12:08:13)
请问，如果在胰酶消化前，细胞之间并不是完全精密贴着的话，本来就存在有间隙，那应该怎么判断消化时间？
one (2012-6-19 12:10:09)
胰酶的消化温度是37度，从-20度取出保存的胰酶消化细胞时，大家一定要注意消化环境的温度。温度越接近37度，所用消化时间越短，消化效果越好。我们都是打开倒置显微镜附带的加热器，在显微镜下观察消化程度。
小野花 (2012-6-19 12:17:01)
个人认为胰酶消化不好有以下几点：
1。胰酶不纯，因为现在市场上卖的胰酶可能是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物，而这里做用的主要是胰蛋白酶，所以建议还是买进口的，比较好。2。可能大家配的胰酶消化液，没加EDTA。我们实验室拿没加EDTA的和加了EDTA的做过对照，效果相差很大。3，即使加了EDTA，也可能没注意到配液中钙离子和镁离子对EDTA的中和作用，导致胰酶效率低，4。温度，最好在消化细胞前把胰酶在37度的水域中预热。
一下资料供大家参考！
1)胰酶: 胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解,导致细胞间质水解而使组织块或单层细胞“消化”为分散的单个细胞。但如作用时间太长,也可使细胞发生严重损伤。2）乙二胺四乙酸二钠(EDTA): 某些组织,特别是上皮组织需要有钙、镁两价离子的存在,才能保持其完整性。如果应用某种物质或方法除去这些离子,就可使组织细胞分散脱离。EDTA就因结合组织中的这些离子使组织细胞分散而被用作细胞分散剂。也是由于这个缘故,配制EDTA溶液必须无钙无镁,且在应用EDTA“消化”细胞后,应该将其倾弃,以免影响细胞生长（这就是所谓的EDTA毒性作用）。EDTA主要用于上皮细胞类原代细胞株或传代细胞系的传代。也曾用于肾脏等组织的“消化”,但其效果似乎不如胰酶。3）现在也有胰酶和EDTA的混合液“消化”。
希望大家发表一下自己在这方面的心得！
any333 (2012-6-19 12:17:57)
我们一直配制的是0.08%的胰酶,用的也不错
zranqi_1 (2012-6-19 12:18:38)
131415 (2012-6-19 12:19:06)
也给大家分享一下吧.
1)等细胞长到90%左右满的时候,去培养基,PBS洗涤2-3次;
2)加入0.25%trypsin,侵润细胞后,将trypsin液体吸掉;
3)将细胞放在37度培养箱中放置2min(这个时间随细胞贴壁程度差异而变,我培养的各种细胞,快的只要30s,慢的要4.5min);
4)用手敲打培养瓶或培养皿,观察到细胞都脱离了,说明消化OK了,如果细胞大部分都还贴壁,需再继续在37度消化一段时间;
5)加含FBS终止液;
6)1000rmp(=200g)离心,3-5min;
7)1:4传代(这个比例也随细胞种类生长情况不同而变,有些细胞太稀完全长不了,有些细胞再少也能长,但1:4是最常规的数字.)
XYZQ (2012-6-19 12:19:58)
那几张消化的图让我受益非浅
我原代培养的乳鼠背部成纤维细胞，没有长到你的48h那张图那么致密，我就传代了，大概只有你的24h的那样，不知是不是不太好
传代后效果也不怎么样
小野花 (2012-6-19 12:20:26)
那几张消化的图让我受益非浅
我原代培养的乳鼠背部成纤维细胞，没有长到你的48h那张图那么致密，我就传代了，大概只有你的24h的那样，不知是不是不太好
传代后效果也不怎么样
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主要看你细胞的生成状况，如果传的太稀，细胞易出现生长状况不好，主要是自己摸索，你可以做一下24，36，48，看一下哪中适合你的细胞。
yysr238 (2012-6-19 12:21:11)
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