[求助]pIRES2－eGFP转染细胞有经验者请帮忙

最新回复

• redbutterfly (2012-6-20 13:01:26)

  
  不知你是固定以后观察荧光还是转染后直接看的，若是固定以后看，可能是荧光已丢失，GFP空载体固定后会存在荧光丢失导致看不到的现象，我就曾碰到过，若不是这个原因，就得考虑质粒或转染试剂是否有问题了，质粒提的质量不好或放置过久都会导致转染失败！找个别人用过确定可用质粒做个对照看看吧，祝好运！

• gogo (2012-6-20 13:01:48)

  不知你是固定以后观察荧光还是转染后直接看的，
  
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  不知道你说的固定是指的什么？

• star#room (2012-6-20 13:02:15)

  
  你好:我是在24孔板转染的,具体操作基本上按照脂质体说明书,经过约20天
  800UG/ML的G418筛选,空载体和重组的多有荧光,在FCM检测约为5%FITC(空细胞调零),在荧光显微镜也看到了(不需要固定,活细胞观察).有图.

  
  39838677.jpg

• gogo (2012-6-20 13:02:59)

  你好:我是在24孔板转染的,具体操作基本上按照脂质体说明书,经过约20天
  800UG/ML的G418筛选,空载体和重组的多有荧光,
  
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  请问，在转染48h后（筛选前）有没有观察荧光，荧光强度，及表达量如何？ 还有就是他们说这个质粒GFP的表达很不稳定（时有时无，最后甚至消失，不知你有没有遇到这种情况？

• 911 (2012-6-20 13:03:55)

  
  转染48h后（筛选前）有荧光,但比例很低,只能看到几个,但无所谓,只要有就行了,要筛选,我在筛选后看过几次,GFP很稳定,一直有.最后祝你成功.

• gogo (2012-6-20 13:05:07)

  
  前两天转了三个质粒今天上午看了荧光，只有其中一个质粒发了荧光，
  而且发荧光的细胞很少，6孔板中几个视野里才一个发荧光的细胞
  不过总算有了进步。
  

• greenbee (2012-6-20 13:06:22)

  请问, 我也是在24孔板转染的, 空载体和重组的都有荧光, 但比例很低,荧光强度也很弱: 在FCM检测空载体强度为16%, 重组的强度为2.2%. 这是不是因为我构建的质粒不好, 还是因为重组质粒转染率本来就比空载体低? 如果是后者,那么转染率通常是多少为好?

• 66小飞侠 (2012-6-20 13:07:22)

  你应该是筛选过的吧,如果达到16%荧光已经很高了,如未筛选就这样高,可能是FCM检测时调零有问题.重组质粒和空载体转染率是否有差别,那主要看你基因大小,一般1000左右差别不大.

• zhezhe (2012-6-20 13:08:14)

  
  楼主用质粒转染的目的细胞是什么？不同细胞的转染效率有很大差别。如果诸多文献公认的难转染细胞，用脂质体等化学转染试剂是不会明显提高转染效率的，这时建议考虑电转染或病毒载体。

• greenbee (2012-6-20 13:08:35)

  
  多谢楼上前辈的建议,我用的是HEK293T细胞,我没做筛选.文献上好象转染率都不低啊.电转后细胞死亡太多了而且细胞形态也变了."基因大小"是说质粒重组后的大小吗?我的是4.7KB ,对重组质粒和空载体转染率会有影响吗?
  对不起,补充一下,因为我做的是启动子这一段,重组质粒转染率比空载体低会不会是说明启动子的效率低?

• BOSS2011 (2012-6-20 13:08:53)

  
  不知道楼主用的是什么细胞？有的细胞很难转的。
  这个质粒我用的很多，转过很多细胞，转染效率和细胞种类有很大关系。
  但是有的时候是和转染试剂和操作有很大关系。

• BOSS2011 (2012-6-20 13:09:45)

  
  293是很好转染的，楼主用的什么转染试剂，你们实验室别的人用的好吗？

• BOSS2011 (2012-6-20 13:10:24)

  
  不知道楼主转染做什么用，一定要追求效率吗？如果是筛选稳定细胞系的话，不需要那么高的效率的

• greenbee (2012-6-20 13:10:42)

  
  我用的是lip2000, 因为我是做启动子这一段的重组质粒,如果效率低,可以说明是我构建的启动子的效率低吗?重组质粒和空载体体外扩增时有差别(重组的明显少),是否转染也同样有这样的差别?

• baidukk (2012-6-20 13:11:06)

  请问楼上,你的稳定转染最后可以百分之多少的表达？,您说“经过约20天
  800UG/ML的G418筛选,空载体和重组的多有荧光,在FCM检测约为5%FITC(空细胞调零)”，后来做亚克隆了吗？多少个克隆中有高表达的？我转染后G418筛选2周后，GFP荧光表达10%，分子表达16%，目前正在亚克隆，就亚了一块96孔板，不知道行不行？请多指导，不胜感谢！！

• langlang (2012-6-20 13:11:55)

  
  楼主的载体是不是PEGFP载体啊？我现在就用的是这个载体，现象和你说的差不多，荧光很弱，转染效率很低。加入G418筛选后，本来有荧光的最后都给筛没了。郁闷，就是不知道啥原因啊！