[求助大家帮忙看看我的hoshest染色有没有凋亡啊？]

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-6-24 18:22 作者: tieshazhang 来源: 分析测试百科网

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如题，在线等谢谢啊

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tieshazhang (2012-6-24 18:23:06)

左边的相对亮点的都是凋亡的细胞核么

51110164.snap.jpg
49888 (2012-6-24 18:23:28)

好像没有，不过你的图片照得不好，好像没有聚好焦，发飘。你有没有清晰一点的图片
tieshazhang (2012-6-24 18:23:51)

是照得不好，用得碧云天得试剂盒，直接用24孔般在倒置荧光显微镜下看得。没加抗淬灭得物质感觉荧光淬灭得很快。没聚好焦是什么意思，就是粗调细调没调好么？再上传一张

14422280.jpg
tieshazhang (2012-6-24 18:24:19)

而且我发现别人做得染色背景都是黑得，而我得却是蓝得，很奇怪
toy (2012-6-24 18:25:23)

显微镜照相效果不好，焦距不齐。
图中的亮点似乎是光路不正造成的过渡曝光。整体感觉细胞没有发生凋亡。
凋亡细胞核应该会发生皱缩、凝集、失去椭圆形态、细胞核内物质紊乱等。
Hoechst染色也不能作为细胞凋亡的最终验证。
yapuyapu (2012-6-24 18:25:55)

而且我发现别人做得染色背景都是黑得，而我得却是蓝得，很奇怪

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激发光波长不对？
tieshazhang (2012-6-24 18:26:16)

多谢了，hochest不是在UV下照得么？因为我调了蓝光和绿光都不行。是不是还要调激发和发射波长啊？如果说Hoechst染色也不能作为细胞凋亡的最终验证，那应该用什么指标呢，我感觉什么指标都有缺点？电镜很难出结果，tunel假阳性很高，PI-ANNEXIN对贴壁细胞也不是很适合.本来准备用几个方法联合做一下得，周末得DNA LADDER结果也不好。还有如果如果用这些方法不能测得细胞凋亡是不是应该换细胞凋亡更敏感得检测方法？因为别人做得MTT还是有趋势得。还是应该做其他得方面得。现在老板催得好紧啊，就想要阳性结果，自己不知道怎么利令智昏得读了博士，很担心自己毕不了业，压力狂大。
redbutterfly (2012-6-24 18:26:34)

我们得倒置荧光显微镜是新买得，还不是很会调，感觉照出得照片比镜下看的还清楚些。如果排除操作原因HOCHEST真的检测不出凋亡是不是说明确实不凋亡还是应该换个方法试试。我的细胞贴壁，用PI-ANNEXIN也不是很好。
帮帮忙吧，在此先谢了。
yapuyapu (2012-6-24 18:28:10)

染液没洗掉，兰色是液体中荧光燃料的颜色？
tieshazhang (2012-6-24 18:29:08)

多谢了，可能是的。我就自己手动摇了三次，每次三分钟。我再试试。
还有再想问个问题，一般大家做凋亡得阳性对照用什么药，我搜了一下有很多，地米作用胸腺细胞，胸腺细胞还要自己原代培养么，很麻烦啊！顺铂、还有42度十分钟，这些方法和自己得细胞类型有关，不知道42度十分钟怎么做难道把整瓶细胞放在水浴锅里放十分钟。我很怕做不出来凋亡想做个阳性对照。在此先谢了。
abc816 (2012-6-24 18:29:44)

我照相也遇到过这种情况。解决方法：染完色要吸掉染料，并用PBS再洗一下。另外就是把曝光时间什么的调一下。背景应该是黑色的才对吧。祝你实验顺利！
tieshazhang (2012-6-24 18:30:22)

好的，多谢了！我用得倒置应该显微镜是新买得，不是很会用，准备把说明书再研究研究
woshituzhu (2012-6-24 18:30:38)

做细胞的凋亡，证明凋亡，你需要用多种方法，并且要适当延长诱导凋亡时间，8-72小时。你的图片太模糊了。

可选方法： Caspase-3 ,Annexin-5,Hochest 33258染色等多种
gmjghh (2012-6-24 18:30:56)

有，但是不多。焦距还是没有调好，如果是数码成像系统，请在监视器上对焦，如果是传统光学单反，同步化是要花点时间练的。
你要对HO33258核染色指标有信心。核形态变化是目前的凋亡金指标之一，是凋亡的充要指标，定性能力强大；结合数码成像系统和IPP分析后相对定量能力进一步提高，除了工作效率，不比流式差多少了。这都不是好指标什么才是好指标？！
tieshazhang (2012-6-24 18:31:24)

多谢楼上的，我们用的是电脑软件拍照，总是拍的效果没有直接看的好，很郁闷，还是要把说明书好好研究研究。请教一下是不是荧光显微镜对焦同时，监视器也要对焦，是不是应该以监视为准。还有HO33258是不是染晚期凋亡？因为细胞核已经变化了.
多谢各位大侠了。
gmjghh (2012-6-24 18:31:43)

在软件还是硬件还是操作产生问题都不清楚的情况下，就应该请工程师帮助调试一下，这个时候就是他们的干活！
核形态的变化出现时间并不晚，在不少细胞模型上甚至早于典型的外观形态学改变，但是的确不是及早变化。
tieshazhang (2012-6-24 18:31:59)

多谢楼上的！我是不是可以理解核变化既不属于早期也不属于晚期凋亡啊？下次照相是准备叫个工程师过来。电话预约时，他说直接用玻片比再24孔板效果好点，即使是倒置荧光显微镜也是这样。准备再试试！
gmjghh (2012-6-24 18:32:18)

不是。
核形态的变化不会凋亡因素一诱导就出现，所以不是“及早”反应，但是早期凋亡就能观察到核形态的轻度而可分辨的变化，而且一旦出现就一直持续变化到最后，早期、中期、晚期凋亡的核形态各有不同，能较好地定性凋亡发展的基本上全过程。