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[求助]细胞突然生长缓慢
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6月22号到协和细胞中心买回来的3T3-L1细胞，带回来的时候培养瓶德的培基是满的，回来后吸掉多余的培基，只剩5ml左右。第二天就发现细胞已经长满，这样就传代。以后三天都是细胞传代后一天就能长满。但是三天后，细胞开始生长缓慢，甚至于感觉不长。
因为用的hyclone的小牛血清是实验室在11年11月份买的，但是一直没用，冻存在-20度，所以分析可能是血清的问题。换了国产的胎牛血清，同时将血清浓度提高到15%，细胞状态比以前好了一点，但还是生长缓慢，甚至不长。好不容易有一瓶长满了，传代后细胞贴壁很少，好多漂浮的细胞，并且贴壁的细胞的形态也不好，状态较差。
考虑到可能是支原体污染，但是当时一共是四瓶细胞，当天只传了两瓶，第二天就发现生长缓慢。然后又把另两瓶传代，还是生长缓慢。
现在很郁闷，不知是什么原因。今天又换液了，把血清浓度提高到20%，不知有没有效果。现在实验停滞不前，哪位战友能帮忙指导一下呀，先谢过了。
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最新回复
ROSE李 (2012-6-26 12:23:10)
建议你问一下协和细胞中心他们培养此种细胞生长液的组成，PH值，用的何种小牛血清，还有二氧化碳浓度等等！
当时我们科也从山东购买了乳腺癌的细胞株，但是可能是水土不符，终究没有培养成功！
如果排除了支原体感染，还是从培养基的配置方面着手找原因吧
zranqi_1 (2012-6-26 12:23:41)
你买细胞时的培养基和你现在用的是不是同一培养基？如果不一样的话，突然更换培养基对细胞肯定有一些影响的。PH值怎么样？
你消化细胞的时候是不是有些过度了？过度的话，肯定不利于细胞生长的！
你的实验室其他人的细胞是不是和你出现同样的问题了？如果是的话，也许你们的培养箱是不是有问题？这样问题都是要考虑在内的！
还有不要天天换培养液，培养液促进细胞分泌一些因子，这些因子可以促进细胞生长的！
wsll (2012-6-26 12:24:15)
啊，忘了说了，我买细胞之前就问过协和那里的老师了，他们用的就是Gbico或Hyclone的小牛血清，与我用的是一样的。楼上说的消化过度倒是有可能，因为3T3-L1细胞很好消化，0.25%的胰酶一加进去就可以看见细胞全掉下来了。不过我的消化时间也不是太长，因为我加入胰酶后，晃一下就加血清中止消化了。
我们实验室最近只有我一个人在养细胞，很晕，应该也不是培养箱的问题，因为在养细胞之前我已经用新洁尔灭擦过三次了，每次擦完再照紫外几个小时。
还有就是楼上群友说的不要天天换培养液，，培养液促进细胞分泌一些因子，这些因子可以促进细胞生长的！我不是很懂，请赐教，谢谢。
wsll (2012-6-26 12:24:31)
wsll (2012-6-26 12:24:59)
昨天打电话问协和细胞中心的老师，那儿的老师说可能是你的培基的PH值不对，偏碱。我就用PH试纸测了一下我的培基，结果是8.0左右，明显偏碱了。不过我当时刚配的时候，培基PH是7.0左右，现在刚过了10天，PH上升太快了吧。
今天去协和另外拿一瓶细胞，去的时候问那里的老师，她说她们也是用Gbico的DMEM干粉自己配培基，他们的培基的PH变化也比较快，他们的解决办法就是再用的时候，5ml培养液中就加入一滴（0.05ml）的1mol/L的HEPES溶液，这样就可以把PH调到正常的范围了。另外她们说可以在培基中加点谷氨酰胺，可以改善细胞的状态。
wsll (2012-6-26 12:25:32)
我想问一下，自己配Gbico的DMEM干粉培基的时候，各位群友，有栽培的时候就加HEPES来稳定PH的吗？那配1L的时候该加多少HEPES呢？我觉得如果不加HEPES的话，PH值变化太快了。
greenbee (2012-6-26 12:26:01)
S6044 (2012-6-26 12:26:32)
似乎hepes培养基的盐浓度和加NaHCO3的培养基有点不一样的
bananapeople (2012-6-26 12:27:11)
我在配置培养液的时候直接加入HEPES和NAHCO3的，每一升培养液加入4gHEPES和3.7gNaHCO3，配好后PH值在7.1左右，过滤后PH大概是7.3左右，之后就基本比较稳定了。
LZ可以参考一下。
dragonkilly (2012-6-26 12:27:54)
细胞有生长周期，在一定时间内长的很慢，但到了对数生长期，就会疯长了。估计等一段时间就好了。加入hepes是为了提高培养基地缓冲能力，使ph值不容易变化，我通常买含有hepes的培养基
wsll (2012-6-26 12:28:24)
我不太了解3T3-L1，
但我想可能有几个方面的原因
1.可能是前面有一次消化过了，细胞受伤了；2：在培养基里面加万分之三的谷氨酰胺，1000ml培养基加2.39gHEPES可能会好些，另外PH大概在7.0左右吧，试试。
拙见
wsll (2012-6-26 12:28:42)
感谢大家的支持，谢谢了。我的细胞正常了，现在状态很好。原因就是PH值的问题，关于DMEM的pH值变化的原因是这样的：DMEM的干粉培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是1.85g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，低于5%，所以液体的PH值也逐渐升高，这就是它变成紫红色的原因。我的培基从刚配时的7.0升高到8.0，变成紫红色了。我知道原因后，就试了一下，把PH值为8.0的培基放到5%二氧化碳的培养箱中，过了几个小时，培基就变黄了，PH值降低了，我测了一下PH值，降到7.0了，就是说降到我当时刚配时的PH值了。这样细胞就好了，再次感谢大家，呵呵，有什么问题大家讨论一下真是收获很大呀。
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