[]求助怎样能证明一个基因可以让细胞凋亡

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• 二丫头466 (2012-6-26 12:46:59)

  
  转染时所设的空转组（不携带外源性基因）对照可用来排除转染试剂和方法对细胞活力的影响。

• 穿越时空 (2012-6-26 12:47:19)

  
  谢谢楼上的
  详细说我的疑惑是这样：我原本打算转个基因到某细胞中（此基因有导致凋亡作用，可能）。但是突然想到转染过程有很多细胞死亡了，如果要判断细胞是否凋亡的话，肯定是要稳定转染，也就是说要加抗生素筛选的，一般加抗生素也在转染48小时后。会不会有这样的情况：在没有到48小时可能就因为我转的基因表达而导致细胞凋亡了，从而没有结果呢？也就是说我根本不可能得到有转基因的稳定细胞来进行后面的分析。但是从有些文献也看见过别人转染过凋亡相关基因的，并且进行过后续研究，不知道其中是否有别的什么玄机，呵呵。从文章看不出的。谢谢！

• 二丫头466 (2012-6-26 12:47:39)

  
  转染我也没做过，只是就你的问题“纸上谈兵”一番：
  如果你的基因一转进去表达就必然导致细胞不可逆的凋亡发生，那你到不如不用筛选了，死了的肯定是转染成功的，你就计数存活细胞的绝对数目来进行比较就可以了（当然还是在保证空转对细胞的生长无影响的前提下）。而且这种情况下你肯定也不可能筛选到稳定表达细胞株。我所看到的有关转染凋亡相关基因的研究报道中，都不是这种有“绝对杀伤力”的基因（不知是不是因为体内凋亡发生的复杂性及机体自稳机制的存在，可能就不存在这种“通杀”基因），所以依然可以凭借摸索适合的抗生素筛选浓度和假以时日，最终获得稳定表达的细胞株，当然这种细胞株都有较高的自发性凋亡趋势。
  一点个人观点，请各位高手支招！

• zsxan1990 (2012-6-26 12:47:53)

  也许可以用一些诱导表达热激表达之类的质粒吧

• 穿越时空 (2012-6-26 12:50:47)

  
  我在文章中看到有人用含有（tTA, tet
  activator;which
  express tTA in a tet-off manner)的质粒来转染，但是文章也没说明白是什么载体。请问楼上的各位知道吗？谢谢！！大概与supermaltose所讲有异曲同工之妙吧。谢谢！

• 2541 (2012-6-26 12:51:05)

  你可以设立荧光蛋白基因作为标记基因,转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞在24小时后应该观察到绿色荧光，同时可以判断一下转导效率；
  同步转染和加压筛选，观察转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞是否会全部死掉；如果同样也死掉了，说明质粒可能有问题，或转染方法有问题（看不到绿色荧光）；如果转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞加压后不死，并形成了抗性克隆，至少有些细胞克隆还仍有绿色荧光，而转染了pCDNA3-目的基因质粒的细胞都死掉了，则说明不是转染或质粒的问题，而是目的基因的表达使细胞发生了凋亡，这正是目的基因的功能。所以你不必试图获得表达目的基因的细胞，即使获得了抗性克隆，也可能恰恰不是你要的细胞，因为它们已经都凋亡了。

• 穿越时空 (2012-6-26 12:51:30)

  你可以设立荧光蛋白基因作为标记基因,转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞在24小时后应该观察到绿色荧光，同时可以判断一下转导效率；
  同步转染和加压筛选，观察转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞是否会全部死掉；如果同样也死掉了，说明质粒可能有问题，或转染方法有问题（看不到绿色荧光）；如果转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞加压后不死，并形成了抗性克隆，至少有些细胞克隆还仍有绿色荧光，而转染了pCDNA3-目的基因质粒的细胞都死掉了，则说明不是转染或质粒的问题，而是目的基因的表达使细胞发生了凋亡，这正是目的基因的功能。所以你不必试图获得表达目的基因的细胞，即使获得了抗性克隆，也可能恰恰不是你要的细胞，因为它们已经都凋亡了。
  
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  谢谢楼主！
  可是我还想做一些细胞形态学，western，rt－pcr等后续实验啊。如果仅仅只是证明这个基因有让细胞凋亡作用，而不做一些后续实验的话基本上不能发什么文章呢。
  但是如果我得不到抗性克隆，后续实验就很不好做呢？或者说是不是即使不能得到稳定转染的克隆，瞬时转染的叶可以做这些实验呢?
  我过去完全没有做过，所以特此请教。

• greenbee (2012-6-26 12:51:48)

  
  western，rt－pcr等后续实验用凋亡细胞应该也可以做的，凋亡与死亡的区别就是胞浆不外流。

• HPLC使者 (2012-6-26 12:52:19)

  
  个人认为，后续实验还是可以做的，要选择好时机，你可以用带有标志性的载体做转染，比如荧光蛋白基因，摸索一下转染进去大概需要的时间、条件（看标记）。要抢在细胞凋亡小体形成做后续实验，因为形成凋亡小体就不好做了。

• 穿越时空 (2012-6-26 12:52:48)

  谢谢各位。
  我也觉得是，如果调亡了，rt似乎是没法做了。RNA应该也降解的差不多了。

• 小鱼鱼 (2012-6-26 12:53:17)

  
  可选用一种需诱导才能表达的载体。这种载体构建的质粒转染后不立即表达，只有在加入某一种外源物（如一种特殊抗生素）后才启动表达。这样就不会在48小时之内影响细胞凋亡了。
  
  当稳定转染后，加入诱导剂，用MTT等方法检测目的基因表达后对细胞凋亡的情况。
  
  同时可以加入目的基因的siRNA，观察目的基因表达被抑制后，细胞是否不出现凋亡。
  
  祝实验顺利。

• 穿越时空 (2012-6-26 12:53:44)

  可选用一种需诱导才能表达的载体。这种载体构建的质粒转染后不立即表达，只有在加入某一种外源物（如一种特殊抗生素）后才启动表达。这样就不会在48小时之内影响细胞凋亡了。
  
  当稳定转染后，加入诱导剂，用MTT等方法检测目的基因表达后对细胞凋亡的情况。
  
  同时可以加入目的基因的siRNA，观察目的基因表达被抑制后，细胞是否不出现凋亡。
  
  祝实验顺利。
  
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  谢谢楼主，可以推荐一下这样的载体么?我要转k562。

• kulee (2012-6-26 12:54:37)

  你可以设立荧光蛋白基因作为标记基因,转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞在24小时后应该观察到绿色荧光，同时可以判断一下转导效率；
  同步转染和加压筛选，观察转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞是否会全部死掉；如果同样也死掉了，说明质粒可能有问题，或转染方法有问题（看不到绿色荧光）；如果转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞加压后不死，并形成了抗性克隆，至少有些细胞克隆还仍有绿色荧光，而转染了pCDNA3-目的基因质粒的细胞都死掉了，则说明不是转染或质粒的问题，而是目的基因的表达使细胞发生了凋亡，这正是目的基因的功能。所以你不必试图获得表达目的基因的细胞，即使获得了抗性克隆，也可能恰恰不是你要的细胞，因为它们已经都凋亡了。
  
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  我也正在做这方面的工作.
  简单的说一说我的做法吧,希望对你的实验有帮助.也希望如果有什么做得不好的地方帮我看看.
  
  1. 首先我用的是PEI转染,感觉效率还可以(有预试)
  2. 然后是对PROMOTER进行活性分析,这个我个人认为没必要,但是以往文章的修回意见里面都建议做……（LUC.分析）
  3. 设定对照组。实验组，EGFP组，空载组。（原因前面的战友已经分析了）如果有时间，可能会做个ＲＴ－ＰＣＲ和ＷＥＳＴＥＲＮ鉴定．
  4. HORCHEST染色或者是TUNNEL上流式对细胞水平凋亡验证。
  5. WESTERN对蛋白水平进行鉴定．
  大概就是这样了．

• 66小飞侠 (2012-6-26 12:54:59)

  我说的载体如pcDNA5.0，上面多加了四环素敏感的启动子，在加入外源四环素后才诱导表达。
  
  供参考，祝实验顺利。

• 穿越时空 (2012-6-26 12:55:19)

  To LZ：
  我说的载体如pcDNA5.0，上面多加了四环素敏感的启动子，在加入外源四环素后才诱导表达。
  
  供参考，祝实验顺利。
  
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  谢谢回答,请问是用的什么方法转染呢?脂质体吗?
  效率高吗?大概可以得到多少比例呢?

• 66小飞侠 (2012-6-26 12:56:03)

  
  我用的是脂质体2000，Invitrogen的。转化效率还可以，主要是能挑到阳性克隆就行了。每太在意比例。