[求助]第一次复苏细胞----郁闷阿

最新回复

• yueban-1147 (2012-6-26 13:23:49)

  
  如果血清出厂时没有灭活那应该自己在56度水浴里30分钟灭活补体.
  还有复苏的时候有没有及时除去DMSO呢?1640配制时间是否长了呢?可以加点谷胺酰胺试试.
  细胞从冻存状态复苏是要有一个适应过程的,而且你这个细胞是三年前冻存的,可能生长是要受点限制的

• is2011 (2012-6-26 13:24:08)

  
  我养过HEPG-2，这种细胞一般长得很快的，一般复苏后两天就可以传代，如果长得慢，要考虑：1、可能有支原体感染，2、你可以试一下把血清浓度加大，可以用含10%的1640呀，3、我用的是10%的DMEM，细胞疯长呀

• dotaaa (2012-6-26 13:24:29)

  
  我来回答吧！这两种细胞我都做过。
  把血清换成20%，可以明显刺激细胞增殖。
  把培养基换成DMEM，用于贴壁细胞培养更为适合。
  复苏的时候一定要用无血清培养基或D-HANKS液洗涤离心至少3遍，接种小培养瓶，有条件可以用一次性塑料培养瓶，贴壁效果比自己处理的玻璃瓶可能要好。2-3天长满。

• gogo (2012-6-26 13:24:47)

  
  谢谢各位，HEPG-2一直感觉细胞上有什么黏附在上面似的，我的培养基加过青霉素和链霉素，没发现细菌污染。但是支原体污染的话是什么样子的呢？
  
  复苏的时候要怎么样及时除去DMSO？ 我问养过细胞的人都说没有必要离心除去DMSO，所以就没做这个。因为是新培养细胞，1640是新配的阿
  
  SMMC7721从很低的密度长起来，长的还不错，也许过两天就可以传代。

• lagua123 (2012-6-26 13:25:05)

  
  支原体污染见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/206260')。另外你看见瓶有没有小黑点在游动没有？如有也可能是黑胶虫污染，我们实验室最近就发现细胞稀少 时有这种污染。如有的话建议重新复苏一瓶冻存时间不长的细胞株。
  赞成jp_sjz的意见，可以将血清浓度加大一些，因为国产的血清浓度有时候标得高。
  复苏时肯定要离心去除冻存液，就我培养过HEPG-2来说，不一定非要离心三遍，一遍就可以了，冻存时间长的细胞复苏时活力是要差一些，一般1：1复苏，忘了问你是1：？比例复苏呀，如果你稀释几倍复苏的话长满肯定要时长。

• XYZQ (2012-6-26 13:25:40)

  
  血清一定要灭活，不过四季青的血清质量不咋样，一般血清瓶的标签上应该有写“已灭活”，如果没有写，就比须灭活（水域56度30分钟）。另外，培养基配好后（加血清前）需要过滤（我估计这是没有问题的）。再另外，细胞复苏时必须除DMSO，方法见：“
  
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  我来回答吧！这两种细胞我都做过。
  把血清换成20%，可以明显刺激细胞增殖。
  把培养基换成DMEM，用于贴壁细胞培养更为适合。
  复苏的时候一定要用无血清培养基或D-HANKS液洗涤离心至少3遍，接种小培养瓶，有条件可以用一次性塑料培养瓶，贴壁效果比自己处理的玻璃瓶可能要好。2-3天长满。

• newway (2012-6-26 13:26:12)

  楼上所说的都有一定道理，但是想澄清几个概念
  1）血清可以不灭活，网上有详细讨论，所以这一步不是主要问题
  2）复苏的时候可以先不除去DMSO，以后换液可自然除去，这一步也不是主要问题
  
  如果你操作正确无污染，三年前冻存细胞在冰箱还是液氮罐？在冰箱（即使—80度），时间长对细胞也不好，要及时放在液氮罐里
  
  另外，冷冻时细胞状态不好，细胞数量太少，都会使细胞复苏失败

• 969 (2012-6-26 13:26:29)

  
  细胞冻存三年，时间有些久了吧，如果是－80冰箱基本存活可能性不太大，我们实验室有一个复苏一年多的细胞就不行了。

• gogo (2012-6-26 13:26:48)

  
  hepg2细胞我是用DMEM 养的,挺好的,还有你的细胞三年前有些长了,细胞复苏后存活率肯定不高,放在液氮里的还好些.我们的DMSO 一般都是去除的,用无血清培养液再离心一次即可.四季青的血清一直觉得还不错,可就在前几天我们测了它的PH居然是7.2,搞的我们的细胞长的张牙舞爪.没法说了.反正细胞长不好是很郁闷的一件事.祝楼主好运.

• woshituzhu (2012-6-26 13:27:14)

  
  HepG2细胞我们用的是MEM,理论上来说用DMEM也可以,但送细胞的博士说该株细胞来自NIH,他们还是推荐用MEM,另外血清用GIBCO,注意一下产地是美国或澳大利亚