[求助]角质形成细胞传代

最新回复

• yychen (2012-6-26 15:27:09)

  
  1. 黑色素细胞不是问题，随着传代会逐渐消失，成纤维细胞比较麻烦．基本上K-SFM应该不支持成纤维细胞的生长，但是如果成纤维细胞数量过多的话，还是不好抑制的．解决方法一个是在做原代时注意尽量避免成纤维的污染，也可以利用差速贴壁去除．总之黑色素和成纤维污染都不算大问题，很好解决；
  2. 角质形成细胞的传代时机的掌握很重要，必须在80%前传代，否则细胞会很快老化．消化时间4min算比较快的了．我的经常是7-8min，细胞长的也很好．

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:27:34)

  谢谢楼上老师， 我在传代的时候先用0.125%的胰酶-0.01的EDTA 37度消化1分钟，倒掉（别人告诉我这样可以去掉一些混杂的成纤维细胞）。然后再加入胰酶-EDTA 37度消化，可能是我晃动瓶底了吧，细胞很容易就起来了，一个养细胞的老师告诉我应该不要让所有的细胞都飘起来，要留1/3的原代细胞继续养，所以我每次消化的时间比较短。请问您是把所有的细胞都消化下来吗？一般1瓶原代细胞传代您都养几瓶（如果不计数）？
  非常感谢您的指点！

• yychen (2012-6-26 15:28:10)

  不同实验室的作法真是差别很大呀．
  1. 你的消化方法很好，可以去除一些成纤维．
  2. 角质形成细胞最好一次全消化下来，1:3或1:4传到新瓶里．
  3. 细胞很容易起来恰恰说明细胞状态很好，如果哪天细胞消化时间变长就说明细胞状态不好了.

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:28:33)

  谢谢！好多文献上都是用dispase酶分离真表皮的，但也有用胰酶的，后者作用范围比较广泛，但如果我在分离真表皮时，表皮很容易分下来，应该也不会混杂太多成纤维细胞吧，加上您说k-sfm基本不支持成纤维细胞生长，为什么我的细胞里还有呢。还有就是我在终止胰酶消化的时候用的是等体积的血清，离心后弃掉上清就加入培养液接种了，这样会不会有血清在培养液里支持了成纤维细胞的生长呢？有人跟我说用等体积的含10%血清的DMEM终止消化，也有人直接用等体积血清中和的，因为实验室没有人用DMEM，所以我选择了后者，这有关系吗？
  非常感谢！

• yychen (2012-6-26 15:29:33)

  1．角质形成细胞是见血清必死（hho稍微夸张了点），血清越少越好，可以配点含10%血清的PBS专门用来中止消化．
  2. 胰酶消化没问题．但是缺点很多，容易混杂成纤维就是其中之一．表皮很容易分下来，并不代表没有混杂成纤维细胞．dispase对基底膜消化较好，混杂成纤维的可能性小些．我专门比较过胰酶和ｄｉｓｐａｓｅ的消化效果，如下图: 左为胰酶，右为dispase．可以看到dispase真正做到从基底膜处分离，而胰酶则界限模糊，很容易混杂成纤维．
  不过胰酶肯定能用，即使混杂较多成纤维，用差速消化也不难去除．

  
  65139031.jpg

• yychen (2012-6-26 15:31:35)

  正好请您帮我看看，我自己都不太会看，还不知道这是不是角质形成细胞就先养下去了。还有我们实验室只有倒置显微镜，没有相差，加上我拍照的技术不好，照片效果也不好。
  这是我昨天拍的传代一次后的照片

  
  91218461.jpg

• yychen (2012-6-26 15:31:51)

  
  这也是昨天拍的

  
  83160331.jpg

• yychen (2012-6-26 15:32:55)

  不必客气．你这个肯定是角质形成细胞，而且细胞状态非常好．可以看到极少量的黑色素细胞(arrows)，基本上看不到成纤维．
  能否把有成纤维混杂的照片发上来看看？

  
  94842371.jpg

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:33:13)

  
  不好意思，我一直以为那些细长的细胞是成纤维细胞，我还不太会认正常的细胞，之前看过一个老师养的黑素细胞，好像是有好多突起的，我昨天没拍，今天换液后拍一下那些我一直以为是成纤维和黑素的细胞请您看一下吧。
  谢谢您一直以来对我的帮助！

• yychen (2012-6-26 15:33:47)

  不好意思，我一直以为那些细长的细胞是成纤维细胞，我还不太会认正常的细胞，之前看过一个老师养的黑素细胞，好像是有好多突起的，我昨天没拍，今天换液后拍一下那些我一直以为是成纤维和黑素的细胞请您看一下吧。
  谢谢您一直以来对我的帮助！
  
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  黑色素细胞形态变化很大，多突起和细长梭形都有．成纤维比黑色素要短一些，粗一些．

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:34:37)

  谢谢yychen老师，今天我没找到典型的我认为是黑素细胞的细胞所以没拍。我的细胞长得很快，我决定练习一下冻存细胞，真对不起我还有一些弱智的问题要问您，我看书上（薛庆善编写）写的冷冻保护液是９份小牛血清或细胞培养液与１份二甲基亚砜混合而成，前天我在DXY上下载了一篇关于细胞冷冻方法介绍的文章，上面写的冷冻液也是加血清，10-90%，我不知道这是不是适合所有的细胞，今天我问了一下导师如果养角质形成细胞用的是无血清的培养基，冷冻的时候还加血清吗，老师没有明确回答我，我没有查到相关的文献，所以又向您求助了。

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:35:00)

  
  还有我们实验室没有-80度冰箱，有个老师告诉我可以先将冻存管放在液氮瓶口待15min，然后放在液氮瓶口与液面之间15min，然后靠近液面但未进入液体再待30min，然后就直接放进液氮中，您说这种方法可以吗？谢谢！

• yychen (2012-6-26 15:36:00)

  你问的都是很关键的问题．
  一般来说冻存液里血清越多越好，因为血清对细胞有保护作用．可以用8份培养液，1份血清与１份DMSO混合．但是角质形成细胞最怕血清，所以在复苏时，必须离心去除血清．
  你们实验室的入液氮法没问题．

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:37:03)

  收集细胞是用胰酶和EDTA吗？浓度跟传代有区别吗？
  真对不起，我总是有很多问题。
  Thank you very much！

• yychen (2012-6-26 15:37:48)

  没关系的．
  和传代完全一样．

• 阿司匹林 (2012-6-26 15:38:25)

  请问楼主：
  我也在此公司买的培养基，请问你买的K-SFM是添加钙剂的还是无钙的？我买的是无钙的，在细胞生长的过程中我没有添加一点钙剂，不知这样可不可以？
  还请问你是把添加剂全部加入基础培养基还是用小瓶分装的？
  还有，一般一个40ml的培养瓶细胞密度是多少？
  我现在也在做角质细胞培养，方法基本同你的，但我养的细胞长的不好，想借鉴一下你的。
  谢谢阿！

• yychen (2012-6-26 15:38:51)

  
  不加钙离子肯定不行．养人的角质形成细胞钙离子浓度应该为0.09mM．

• 伊莎贝拉 (2012-6-26 15:39:14)

  
  我买的是低钙的。
  因为我还是在尝试养，用的培养液不是很多，二者的保存温度不一样，所以培养基、添加剂我都是分装后保存的。
  我没有进行细胞计数，我还没有买细胞计数板，每次先加一瓶，在镜下看一下，密度差不多我就养了，不过真正做实验应该都计数吧，记得有文献上写原代细胞大约3×10６放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基，具体的yychen老师应该最有发言权了。

• vvmmoy (2012-6-26 15:39:44)

  
  请问,你用的分离皮肤的胰酶是多少浓度,一般消化多长时间!能具体告我下吗!

• remenb (2012-6-26 15:42:22)

  
  请教楼主:
  我现在也在养角质细胞,但效果不好,能否方便说一下你的步骤,我可否参考一下?
  万分感谢!