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[求助]关于质粒提取与纯化
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各位群友请教一个问题：转染细胞用的质粒纯度应该达到什么标准才可以呢？比如260/280，260/230的比值该在哪个范围？我最近好几次了用传统的碱裂解法大提质粒，纯度一直不高260/280到了2.05，260/230到了2.5-2.6，我的纯化方法是：RNAase37度作用半小时，然后Tris饱和汾抽提两次，上清再24：1的氯仿：异戊醇抽提一次，之后是无水乙醇沉淀，70%的乙醇清洗。后来我又重复过上述纯化过程一次，但是结果没有改观。这个方法我曾经提过一次结果不错的质粒，260/280到了1.80，但是最近就是不行了。郁闷至极，都打算改用试剂盒了。请大家帮忙分析一下。多谢！另外，如果选用试剂盒不知道哪个牌子比较好，请大家帮忙推荐。谢谢！
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最新回复
wmp1234 (2012-6-26 17:37:58)
可能是RNase的活性出现问题了吧？建议换RNase再试试。
我们实验室大抽也不用试剂盒的，基本步骤如下：
1，plasmid粗提，估计大家都差不多吧，都是溶液1，2，3加完后离心，插镜纸过滤，1：1异丙醇沉淀，酒精洗，加TE溶解。
2，加LiCl，沉淀离心，取上清。
3，1：1异丙醇沉淀，酒精洗。
4，用RNase（20ug/ml）溶解沉淀，37度1小时。
5，1：1加入PEG8000，冰上放2h以上。
6，沉淀离心，TE溶解。
7，饱和酚抽提一次，1：1饱和酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次。
8，酒精沉淀，酒精洗，溶解。
好像一般也没有什么问题啊
cj_mondy (2012-6-26 17:39:23)
我们实验室用过TaKaRa和promega的,便宜,也算好用
wmp1234 (2012-6-26 17:39:40)
谢谢两位的经验分享
不知道你们提的效果如何
那俩比值能到什么程度
关于RANase我想应该没什么问题的，我新配的那个好像没溶好有点沉淀，后来换了一种，还是不行。
还有上边那位你的方法好像比我的时间还长，我的基本上要一整天。
Ao7 (2012-6-26 17:39:57)
转染细胞，我们实验室都使用的qiagen得。
理论上要求用endofree，不过只要细胞不是特别敏感娇贵的，通常普通的qiagen级别就可以了。
大概600多块钱一次，能抽十几mg
相同质粒还可以反复用个几次
小抽鉴定一般用的国产试剂盒，博大泰克的比较便宜，效果也还可以
wmp1234 (2012-6-26 17:40:27)
谢谢，qiagen的好像很贵的，我最后订了一个promega的，25次包装，1400元左右。因为以前没用过此类试剂盒也不知道好用不好用。
vera+ (2012-6-26 17:40:44)
我们一直用promega的中抽试剂盒，25次包装，每次抽提的260/280的比值一般都在1.7以上，用来转染，效果很好。
wmp1234 (2012-6-26 17:41:01)
请教楼上的：
我买了一个A2492的，25次中提盒子 ，估计跟你的一样。里边说明书提到离心机要用swinging bucket rotor，请问这是哪种离心机？还有提到要把柱子放到50ml disposal plastic tube中，请问这个管子指什么呢？是通常用的50ml的离心管么？离心的时候是不是要把柱子放在里边，并且不盖盖呢？盼请指教。
最好能把经验分享一下。谢谢
阿敏 (2012-6-26 17:41:24)
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