【分享】反转录差异显示技术DDRT-PCR

　　差别显示聚合酶链反应(DDPCR)，又称差别显示反转录PCR(DDRT-PCR)，或mRNA差别显示法，是Liang等1992年建立的一种以 PCR为基础的、能快速有效地鉴别并克隆一对组织或细胞间差别表达的基因的方法。时至今日，短短几年间，该技术已广泛应用于分子生物学研究的各个领域，如基因调控、信号传导、细胞凋亡、细胞对药物和基因治疗的反应等。在对多种疾病，如乳腺癌[3]、糖尿病[4]、心脏病[5]及神经系统疾病等的研究中，通过这一方法找到了许多疾病相关基因，甚至是新基因，大大丰富了我们对复杂生命过程的理解。

　　一、背景及历史回顾

　　高等生物一般具有十万个基因，但单个细胞仅表达其中的15%，约15 000个基因。基因表达的选择性决定了生命的全过程，如发育分化、稳态、细胞凋亡及细胞对损伤的反应等。正常发育过程或病理变化，无论是单基因突变还是多基因的综合作用，本质上都是基因表达改变所致。同时显示并比较一对细胞或组织的信使核糖核酸(mRNA)，可找到两者间的差异表达基因，为我们进一步理解生命的本质提供信息。

　　传统分析基因表达的方法：cDNA文库差别筛选(differential screening)和减数cDNA文库(subtracted cDNA libraries)的构建。这两种方法的技术难度大、耗时多，均要求构建高质量的有代表性的cDNA文库，只能比较给定时间点一种方式的基因表达，所以只能检测出组织中表达相当高的基因，而且,减数杂交只能显示翻译过程中变化较大的基因。DDPCR在既往研究的基础上，经合理设计能系统的比较不同组织和细胞间mRNA的表达，在一定程度上克服了传统方面的不足。

　　二、原理

　　DDPCR的基本原理：利用随机引物扩增所有的mRNA，并通过测序胶电泳显示出大小不同的条带。其依据：绝大多数真核细胞的mRNA 3′端均有polyA尾，表现为5′…M′N′AAAn 3′(M代表A、G、C、T，N′代表G、C、T)，M′、N′ 随机组合只有12种mRNA，用人工合成的 (Oligo-dT+MN即T12MN，M代表A、G、C，N代表A、G、C、T作为3′ 端引物，分别对总RNA进行反转录，可获得1/12的cDNA亚群，然后用5′端随机引物对cDNA亚群进行PCR扩增，因5′端引物与cDNA结合是随机的，因此，来自不同mRNA的扩增产物大小也不相同，经测序胶电泳可显示差异表达的cDNA片段。重新扩增并克隆这些片段，用其作探针就可以从cDNA 库或基因组库筛选全长的cDNA或基因组克隆。理论计算用24～26种5′端10-mer随机引物，与每一个3′端引物配对，经288次或312次PCR 反应，几乎可以覆盖所有的mRNA。

　　完整的DDPCR由3个基本步骤和2个附加部分组成：

　　(1)反转录(RT)：将mRNA反转录成cDNA;

　　(2)PCR：扩增cDNA;

　　(3)测序胶电泳显示差异片段;

　　(4)差异片段再扩增克隆;

　　(5)确证差异并测序：Northern Blot及序列分析。

　　其优点：

　　(1)简单、快速，能短时间内同时比较几种组织和细胞的基因表达，找到与疾病或信号刺激相关的基因，甚至是新基因;

　　(2)灵敏，扩增细胞中的所有mRNA只需不超过5 μg的总RNA;

　　(3)重复性好，如果一条差异带能重复一次，则90%能多次被重复;

　　(4)可同时检测上调和下调基因;

　　(5)可同时检测只出现于健康组织中的基因(如肿瘤抑制基因)和只存在肿瘤中的基因(如肿瘤标记物、激活的致癌基因等)。