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[求助]MTT的另类用途
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很多战友们在用MTT时，一般用在细胞接受药物之后的OD检测，后者反映细胞生长情况，从而评估药物的作用（比如肿瘤细胞的抑制作用）
不知有无这样的用途：我做骨髓间充质干细胞，为了描绘其正常状态下的生长曲线，在细胞接受诱导因子作用前进行了MTT!具体步骤如下，请各位斧正：
1)配制：MTT(5mg/ml)，DMSO
2)接种：对数生长期细胞按1×10*6/ml密度接种到96孔板，每孔100μl(103-105个细胞)。
3)呈色：培养3-4天后，用温PBS洗涤培养板，每孔加MTT溶液10μl（MTT终浓度为0.5mg/ml），37°C培养箱孵育3-4小时，倒置显微镜下观察，直至肉眼可见细胞内的斑点状紫色沉淀物，终止培养，移液器小心移去孔内培养基（≈100μl）。每孔加100μl有机溶剂DMSO（与丢弃培养液的量相等），轻轻摇晃（10min），避免Shake，使结晶物充分融解。盖上盖子，室温下避光2h。（或培养箱内过夜）
4)比色：选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值A（包括空白对照），记录结果，对照波长≥650nm，空白孔吸光度为±0.1。实验重复3次，连续测量7天。
5)绘图：吸光度=3个复孔读数平均值-空白孔数值，则吸光度对应细胞数目（ml）
以时间为横坐标，吸光值A为纵坐标绘制细胞生长曲线。A值高，则增殖快。
6)空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
调零孔：培养基、MTT、二甲基亚砜
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最新回复
yychen (2012-6-27 17:34:13)
any333 (2012-6-27 17:34:33)
请求指点！
kewanqi2011 (2012-6-27 17:34:58)
用MTT做细胞生长曲线是很常规的．不过你的步骤不太符合生长曲线的作法，首先接种细胞量过高，而且生长曲线应该每天都测吧．好久不作了，都忘的查不多了．
看看书上咋说的.
any333 (2012-6-27 17:35:21)
呵呵 多谢您的回音！
是啊，忘了写出来，我是连续测量7天的，skinner觉得是原代细胞直接接种在96孔板，还是传到第3代后再转接种到96孔板，似乎后者更简便些。
yychen (2012-6-27 17:35:47)
后者是正确的．做生长曲线的细胞密度应该是10*4/ml．
any333 (2012-6-27 17:39:05)
yychen (2012-6-27 17:39:41)
guagua (2012-6-27 17:41:46)
有个小经验：因为测生长曲线要每天测，但是酶标仪检测时有可能污染细胞，所以我另外再拿个96孔板，将每次要检测的组中DMSO吸出来加到相应位置的新板中，再上机测。这样就省得污染了。还有，如果测7天，一开始细胞量可能还要少些才好。
junjie05 (2012-6-27 17:42:03)
1。题目有点偏了，就是MTT的最基本的用途，测量活细胞的数量。
2。首先应该对测定细胞的活细胞数量与MTT反应后测定的OD值作线性范围的确定。譬如，最低可从500个细胞/孔做起，然后1000个/孔，2000个/孔，4000个/孔，8000个/孔，。。。。， 并且每个细胞浓度设三复孔或者四复孔。以上测定，可以在细胞加入培养板放入培养箱2～4小时后，即可加入MTT，然后测定，不要细胞增殖，以免细胞数量增加。
3。在确定活细胞数量（浓度）和OD值的线性关系确定的范围内，确定所要接种细胞的起始浓度（可以是可测出的最低OD值对应的细胞数量），然后再每天测定细胞增殖后的OD值，以间接反映细胞增殖的数量。
4。测定OD值还是应该再570nm，因为其蓝色反应地物的吸光峰值接近570nm。可以吸出底物反应液体用分光光度计扫描吸光度频谱确定。
flower-201 (2012-6-27 17:43:07)
常规做法....
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