[求助]胶原酶的消化

最新回复

• toy (2012-6-29 15:58:24)

  
  如果是透明的粘稠，多半是细胞破裂后的DNA所致
  加入DNAse酶到细胞悬液中，然后用吸管吹打几次，就好多了。过滤也容易多。

• fsdd817 (2012-6-29 15:58:50)

  
  我也在消化组织细胞，我的消化酶里还有胰酶和DNA酶，我不是20分钟吹打一次那样对细胞损伤比较大，我只是20分钟摇一摇，1个小时后吹打并取一点看一下分散的可以了就终止消化。

• eric930 (2012-6-29 15:59:17)

  
  我建议消化以后离心然后用DNase处理一两分钟就可以了. 不过我做的是lung cancer cell, 可能不太一样

• shenkunjie (2012-6-29 16:00:01)

  我也在消化组织细胞，我的消化酶里还有胰酶和DNA酶，我不是20分钟吹打一次那样对细胞损伤比较大，我只是20分钟摇一摇，1个小时后吹打并取一点看一下分散的可以了就终止消化。
  
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  能分享你配制的消化液的成分吗?

• vcve (2012-6-29 16:01:28)

  下面是我得方法, 对象是mouse lung adenocarcinoma, 和大家交流一下.
  
  1. 消化液: collagenase (300 unit/ml, #C9891, Sigma) + dispase (1.0 unit/ml, GIBCO, 17105) + Trypsin (0.02% 我觉得可有可无) in PBS for 2 hours at 37℃ water bath shaking incubator.
  2. 离心以后用NDase 处理一分钟
  3. 用 40 um Cell Strainer (#352340, BD Falcon)过一次 , 离心.
  4. 在我的实验里, 这样基本上可以得到单细胞.
  
  其实我个人觉得, 第一次帖壁得效果对原代细胞很重要, 细胞密度太大, 很多帖不上; 细胞密度太小, 不好长.

• yychen (2012-6-29 16:04:06)

  下面是我得方法, 对象是mouse lung adenocarcinoma, 和大家交流一下.
  
  1. 消化液: collagenase (300 unit/ml, #C9891, Sigma) + dispase (1.0 unit/ml, GIBCO, 17105) + Trypsin (0.02% 我觉得可有可无) in PBS for 2 hours at 37℃ water bath shaking incubator.
  2. 离心以后用NDase 处理一分钟
  3. 用 40 um Cell Strainer (#352340, BD Falcon)过一次 , 离心.
  4. 在我的实验里, 这样基本上可以得到单细胞.
  
  其实我个人觉得, 第一次帖壁得效果对原代细胞很重要, 细胞密度太大, 很多帖不上; 细胞密度太小, 不好长.
  
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  一点建议∶DNAse的处理最好放在离心之前．

• vcve (2012-6-29 16:04:42)

  为啥DNAse的处理最好放在离心之前?

• yychen (2012-6-29 16:05:08)

  消化细胞会导致部分细胞破裂释放DNA，聚集成网状，包裹细胞，不但在接种细胞时影响细胞贴壁．离心时也会导致部分细胞不能沉淀，最终损失部分细胞. 所以最好在消化时把DNAse就加上.