[求助]请教悬浮培养的细胞筛稳定株的一些问题

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• avi317 (2012-7-03 10:00:41)

  
  我养过些悬浮细胞，用脂质体转染效率都不是很高，一般是用电转．但是用的是已配好的电转保护液，细胞量要 大于1.5 x 105就可以了．
  悬浮细胞的筛选：活的细胞是透亮的，折射大，你可在显微镜下看到，这样你可以把上清吸到新的瓶在培养，这样两三次就可以去掉死细胞了．

• IAM007 (2012-7-03 10:01:08)

  谢谢楼上！！
  我还想请问几个问题：
  你电转之后是把细胞种到什么里面？培养瓶吗？
  你能告诉我电钻保护液的配方吗？是不是用保护液来代替电转液呢？你是不是用amaxa公司的电转仪？用保护液代替电转液的话机器不会报错吧？
  电转的dna量多少呢？
  筛选细胞的时候把上清液吸到新的瓶子里会不会把死细胞一起吸过去？你的“两三次”是指同一次传细胞的时候要用2、3个新的瓶子从一个往另一个里面吸新的上清吗？

• avi317 (2012-7-03 10:01:34)

  
  你是还问了其他的吧.
  你种96孔板是做的亚克隆吗?你可通过肉眼就可以初步看阳性细胞,在板底看,细胞长的是一大团,不是分开的,在在显微镜下看,一般细胞长到七天就可看到了,你也可取它变黄的培养基做ELISA,这样就可确定是阳性细胞了.
  一般这样的细胞筛选在2.3次后,如果还有很多死细胞,那就是你的细胞状态不是很好了,你就可用比较好的血清养,我以前养悬浮细胞时加谷氨酰氨,现在没有了,细胞还是很好的.

• IAM007 (2012-7-03 10:01:57)

  嗯，是先挑选阳性细胞，然后种到96孔板里面，我还没有做，只是实验室有师兄是这样筛贴壁细胞的稳定株的。我不知道悬浮细胞是不是也一样。
  你说得比较好的血清是什么意思?是说加大血清含量百分比吗？还是换别的公司的？我的P815是死得很多，不过后来加了谷氨酰氨之后好一些了。
  另外，还想请教一下：你养悬浮细胞的时候怎么换液的呢？我就是把全部吸出来离心，然后加入新鲜培液，可是这样的问题就是死细胞也都一直没法去掉，我觉得死细胞的存在也可能对活细胞有所影响的。
  

• IAM007 (2012-7-03 10:02:14)

  
  还有个问题哦，悬浮培养的阳性细胞会沉到瓶底吗？我猜想是不是会仍然悬浮，只不过是一大团？嘻嘻，偶没做过，瞎猜的~~~~

• avi317 (2012-7-03 10:02:49)

  
  血清：也可加大它的百分比，这是一种，还可以比如先是新生牛血清，这时你可用胎牛血清。更好的可用进口的。
  死细胞对活细胞是有影响的，悬浮细胞离心次数太多不是很好，我一般是先加少一点，等要换培养基时，不离心，直接再加培养基，这样活的细胞会多。
  这要看是什么样的悬浮细胞了，有的再长的很好时是可以沉到瓶底的，
  我不是很清楚你养的是什么样的悬浮细胞，但要筛选稳定株，我都是用上面的方法。

• IAM007 (2012-7-03 10:03:11)

  我养的是P815细胞，就是mouse mastocytoma cell line. 昨天刚刚电转了，24小时以后就加G418，不知道接下来会发生什么~~~~
  谢谢哈！

• avi317 (2012-7-03 10:03:38)

  
  1 准备一块96孔板，细胞记数，每孔约为1X104个细胞，每个G418筛选浓度设4个副孔，正常对照设4个副孔。
  2 加入浓度为100ug~1200ug/ML的G418培养基进行筛选。
  3 1到2天观察细胞的生长状况，浓度为1200ug/ML的孔的细胞几乎都死亡。
  4 在一定天数（7天左右）会发现浓度为大于600ug/ML的孔的细胞都死亡，在500ug/ML的孔的细胞有死亡，但也有活的细胞，这样会定G418的筛选浓度为500ug/ML.
  5 按计划准备所需的细胞转染质粒24小时，弃去培养基，更换浓度为500ug/ML的G418培养液进行筛选。
  6 在培养的中间洗去死细胞，仍需用浓度为500ug/ML的G418培养液进行筛选，在第7~9天时收集细胞。
  你是做稳定筛选吧，可能这个时间你还要摸，就是我上面所说的．

• IAM007 (2012-7-03 10:04:19)

  嗯，我是在做稳定筛选，不过还有一个小问题，你说“在培养的中间洗去死细胞”这点我还是不很明白，怎么洗？细胞都是悬浮的，即使我用离心，也还是有很多死细胞都离下去了，无法和活细胞分开啊
  
  再一次谢谢你的指教

• wsll (2012-7-03 10:04:36)

  
  我的p815细胞是贴壁生长的，没有污染过，而且贴的很牢固，不用说吹了就是用胰酶消化也很难下来，长的飞快，各位同学分析一下是不是有什么问题啊？

• IAM007 (2012-7-03 10:05:19)

  郁闷了~~~偶的细胞10天过去了都没看到有荧光，郁闷~~~
  请教这里的各位老师：稳转的话质粒是不是要线性化呢？