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[求助]幼鼠心肌 分离 受挫！
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最近 做了三次 新生红皮鼠 心肌分离 实验 ，第一次用了0.05%trypsin /0.1%collagen消化 ，消化过程中没有出现粘稠消化液，但是消化后的细胞都只有碎片。第二次改用0.25%trypsin消化，出现粘稠消化液而且细胞最后只有碎片；第三次用0.1%trypsin消化，仍有粘稠，最后还是有很多碎片，24h后细胞仍是圆形，未贴壁。胰酶是含有 EDTA的 sigma 原液，每次消化液中都加了1％BSA。想请教各位高手，究竟是 什么原因 导致我的 细胞都碎了？
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最新回复
tangxin_80 (2012-7-03 10:50:43)
我也做了好几次,都不成功,和你的情况差不多,
我一直用0.1%胰酶,有粘稠消化液.看不到细胞,估计是成碎片了
你消化的时候用磁力搅拌器搅拌吗?
另外时间也很重要,好象很多文献都是分多次消化的.
bamboo16 (2012-7-03 10:51:02)
以为做心肌很简单～～难啊难啊～～～
yueban-1147 (2012-7-03 10:51:33)
心肌细胞培养 取1-3d龄Wistar大鼠15-18只，无菌条件下剪取心脏，仔细剥离心房及大血管组织，于预冷的PBS液中漂洗5次。将心肌组织放于50ml离心管的侧壁上，倾斜离心管，吸净管底液体，用眼科小弯剪将组织剪成约1mm3碎块。加入5倍体积的0.08%胰蛋白酶和0.1%胶原酶（1：1），反复吹打后37℃消化7min，静置，待自然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及0.1%胶原酶混合液，置37℃消化5-8min，静置后将上清液移入10ml离心管中，反复吹打至无细胞团块后用等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化，一般经7-10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以800r/min离心10min，弃去上清液后将细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液，然后接种于50ml培养瓶。37℃、5%CO2培养箱中孵育2h后，轻轻吸出细胞悬液，以105/ml的密度接种于50ml培养瓶和六孔板（板底铺盖玻片），置37℃、5%CO2培养箱中培养。48h后更换培养液，以后每2-3d换液1次。
one (2012-7-03 10:53:19)
也有做贴块培养的
不用胰酶消化，等爬满瓶底后再消下来实验
wsll (2012-7-03 10:53:41)
你可以看看你的配液 胰酶和取材都很关键，我用的是0.08%的胰酶用D-hanks配的，一开始我也没有养活，但是重新配液以后就活了。
wsll (2012-7-03 10:53:57)
还有就是你用的血清，我们用的是杭州四季青的
bamboo16 (2012-7-03 10:54:29)
谢谢各位大虾！我用的是hyclone的FBS，胰酶是sigma 的，不过好像听说胰酶里不能含有EDTA?为什么国外文献却有用0.25%trypsin/0.1EDTA一样消化的很好啊 ？楼上的消化中没有用到DNAnase，是不是没有出现粘稠的现象啊？还有，加了BSA是否对心肌的活力有显著影响？
vera+ (2012-7-03 10:55:21)
wsll (2012-7-03 10:55:57)
QUOTE:
我们实验室有用hyclone的，我穷，只能用四季青的胰酶可以和EDTA混合，一般是1：1，EDTA浓度0.02%，由于EDTA作用机理是鏊合钙镁等金属离子，不能用血清中和，要通过多次洗涤和离心才能去除，我觉得不方便
我的实验中单纯用胰酶消化时出现过粘稠现象，但加用胶原酶后这种情况好转；还有，消化时候一定要振摇，摇到澄清的液体变浑浊就是终止的好时机，收集悬液的时候，最好多吹打下，然后从新静止大概1分钟左右后收集
对于BSA，我师姐做过神经母细胞瘤细胞，可诱导凋亡，在心肌上我没做过
wsll (2012-7-03 10:56:38)
QUOTE:
那请问你用的是单纯胰酶消化的嘛？还是和胶原酶或DNAnase混和消化的呢？[求助]幼鼠心肌 分离 受挫！