[求助]我的细胞怎么了？

最新回复

• 969 (2012-7-03 17:48:31)

  
  完了，又一个上海来的细胞这样，我的细胞也这样，另外还有一位仁兄也是上海的小细胞说死不死，说长不长的，同时养别的细胞都没问题。似乎细胞不适应，要不就是缺氧，好像都不太对解释
  
  怎么办啊

• ending (2012-7-03 17:48:52)

  
  我在上海，去年买的HepG2在中科院细胞库，长得还挺好的，我拿细胞的时候那个老师交待一定要细胞长满了再传代，你传代的时候是不是密度不够啊，密度不够可能就长不起来，此外你用的什么培养基？应该用MEM 加10%进口血清或是15%国产血清。如果你的细胞还有活着的话，你把它消化下来放在一个小皿或是6孔板里面去，让接种密度大一点，看他能不能恢复活力，我做它一直是一传二，两天半能长好，隔天换液。

• H2O (2012-7-03 17:49:16)

  
  谢谢楼上的建议，只可惜我的细胞已经全都死了，不过我又新要了一株细胞，所以很希望找到上次失败的原因，增大这次培养成功的概率。
  我从上海买的那株细胞，人家原来使用的培养基是1640+10%FBS，而我用的是MEM+10%FBS（四季青)，我不知道培养不好是不是更换培养基的原因呢？但是我在资料上查的都说培养HEP-2细胞建议使用的培养基就是MEM+10%FBS,而且以前师姐培养这种细胞的时候也是用的MEM。
  我给上海打电话咨询，人家说可能是瓶子的问题，因为我们用的是玻璃瓶。
  这次我们实验室买了1640培养基，也买了一次性的塑料瓶。但是我还是担心问题不仅仅是这两方面，不知道大家还有没有其他建议呢？

• H2O (2012-7-03 17:49:40)

  ending：
  我做它一直是一传二，两天半能长好，隔天换液。
  
  抱歉我是新手，想问一下你上边的话怎么理解阿？你说的换液，不是指传代吧？那你一般多长时间传一次代阿？

• hold住 (2012-7-03 17:50:03)

  我觉得你的细胞死亡的主要原因有两个：
  （１）细胞培养一般不能更换培养液品种，否则细胞不适应新的培养环境引起死亡．你取来的细胞只能用同种1640+10%FBS，而且要保证培养液新鲜，1640培养液颜色变浅粉色时必须弃掉，或者把1640培养液放到二氧化碳培养箱中调整PH值至颜色为原来的红色。
  （2）细胞培养一般用一次性塑料瓶，此种塑料瓶经过硅烷化处理，可以使细胞贴壁生长。
  另外，细胞长满细胞培养瓶底时一传二为传代，细胞生长状态不佳时将其离心收集重新加入培养液为换液。
  我做细胞培养时也经常碰到各种问题，但只要尽量保证无菌，可放手去做。细胞也有一个适应过程，时间长了就不会出问题了。

• misswu61 (2012-7-03 17:50:55)

  和我的细胞一样，我的细胞也是死的越来越多，贴壁的越来越少，最后一夜全死掉了，只是我的不是从上海买的，你看一下细胞之间有没有一些黑色的小黑点，在高倍镜下可以看到能快速抖动？但培养基的颜色并没有变黄，还是清亮的，

• jrwyyplt (2012-7-03 17:51:16)

  
  1.刚买的细胞如果养不好,最好用塑料瓶,较玻璃瓶的效果好.我买的细胞都是先用塑料瓶养的
  2.刚买的细胞不能立即传代,必须等细胞密度差不多的时候再传,或者是消化下来原瓶传代..刚买回来,应在培养箱培养一段时间,怎么能立即传代呢
  3.看是不是培养基的营养不够.用好一点的血清并加大血清用量

• 49888 (2012-7-03 17:52:07)

  
  我养过HepG2。有一次用错了培养基，本来要用DMEM，用成了1640，细胞全漂起来了，再换回去也不成了。

• H2O (2012-7-03 17:52:24)

  我收到细胞的时候细胞长的已经很密了，所以我才传开的可是传开以后就贴壁效果不是很好了，这会是什么原因呢？

• H2O (2012-7-03 17:52:44)

  我想问一下，贴壁细胞怎么离心阿？
  是不是还要把它先消化下来?可是要是细胞长得不好，再消化换液的话，细胞就更长不起来了阿？
  还有，我想问一下你以前有没有出现过细胞贴壁很少的情况阿？你一般怎么处理阿？为什么我把旧的培养液倒掉，加入新鲜的培养液结果第二天细胞全都飘起来了？但是培养液并没有变混浊，镜下观察也不像是污染，这会是什么原因呢？

• ending (2012-7-03 17:53:05)

  楼主你好，这个细胞应该是用MEM+10%进口血清或15%国产血清养的。我两种都试过，都可以，要不你把血清浓度加大一点。对了，还有一点是HepG2传代后第一天贴壁是贴的不平展，用你的话说是贴壁效果不好，不用着急，第二天它就会慢慢铺开，说通俗一点第一天面目是有些狰狞，第二天就舒展开来了，你观察看是不是这样，尤其是传代前细胞长满了，传代后第一天就是这样，若是传代前细胞不是很满，密度比较好的话，第一天它就以单细胞形式铺开，比较好看。我的做法是，传代后第一天keep,不动，第二天换液，就是丢弃掉旧的培养基，加入新鲜培养基，第三天密度有90——95%做一传二，对此细胞要有耐心，它会长好的，比较皮实

• H2O (2012-7-03 17:53:30)

  enging你好，谢谢你对我的帮助指导，不过我培养的是Hep-2细胞（人的喉癌细胞），不是HepG2细胞(人的肝癌细胞），不知道情况是不是一样啊？不过对我来说你的经验真的是让我受益菲浅，发自内心的深深的感谢你！

• wu11998866 (2012-7-03 17:53:47)

  
  我昨天刚刚配置了1640培养基，可是颜色偏紫，用ph计测是8、5，我好担心阿，怕ph值太高了细胞都死了，我的细胞昨天就收到了，可是因为培养基ph值的原因，一直不敢动，谁能帮帮我啊！加血清ph值是不是会有所下降阿？因为我们实验室没有co2，所以现在很犯难！！！
  
  我的配置是直接加入2gNaHCO3进行抽滤除菌。

• ending (2012-7-03 17:54:29)

  
  我们实验室也没有二氧化碳，我配1640的做法是加入2g碳酸氢钠，用1N的盐酸调ph到7.2（用ph计），因为正压用滤器过滤会使ph上升01-0.2个单位，所以如果上升的话ph到7.4刚好。ph8.5太高了，太碱了细胞会死的，细胞是耐酸不耐碱的，建议你还是重新配，调ph后再过滤，原来的就不要了，这样是浪费了一点，不过放心一点，我想血清不会改变ph太多的，因为里面没有酸碱性的东西，所以不大会改变ph的。

• ending (2012-7-03 17:54:45)

  H2O你好，实在抱歉我没有看清你的细胞就给你回帖了，hep-2细胞我没有养过，不知道你现在养得怎么样了，如果是较难养的长的慢的细胞，你就等它密度长得大一点比较满的时候做一传二，做的保守一点。隔一天换一次液让它慢慢长起来，如果有五六天时间还没长满，你就做个一传一，就是把它全部消化起来放入一个新皿/瓶养，激活一下它，这样一方面淘汰掉了不好的细胞，另一方面换了一个干净的环境，原来的瓶里面堆积的细胞代谢物比较多了。

• H2O (2012-7-03 17:55:05)

  不过我想问，我看资料上说不能用HCL调节ph这样会引入氯离子， 你们这样做没有出现过问题吗？

• ending (2012-7-03 17:55:23)

  我查了这个细胞原来也是atcc的细胞，链接见下
  cuturl('http://atcc.org/common/catalog/numSearch/numResults.cfm?atccNum=CCL-23')
  不知道你看了没有，这个细胞应该还是挺好养的，不过你的培养基是和atcc的不一样，营养稍差了一点，不过你要的细胞可能已经被国产化了，被1640和国产血清驯化了，所以你还是按照给你细胞那个单位的培养基去养，你换了培养基细胞可能又反应不过来了，所以恢复状态比较慢，此外这个细胞不用离心，照片我看了，形态比较好，你做一传二就是了，别做传四，等长起来了可以试着传大一点

• ending (2012-7-03 17:56:41)

  自己顶一下吧，大家谁还培养Hep-2细胞阿？有什么经验，交流一下吧！

• ending (2012-7-03 17:56:58)

  我一直用1N盐酸调各种培养基的ph值，用起来没有问题，但是要用的快一点，因为盐酸没有缓冲作用，所以培养基很容易变碱,而用二氧化碳调节,它会与碳酸氢钠形成缓冲复合物，缓冲能力较大，因此可以保持较为稳定的ph，但是你看gibco的说明书也就是DMEM的包装盒上写的配置方法就是拿 1N HCL或NAOH调ph，所以这样做也没有问题
  hep-2的养法你在dxy里面再搜搜看有没有

• H2O (2012-7-03 17:57:25)

  enging。真的很感谢你一直对我的帮助,不过我又有一些新问题想讨教一下
  1 你在配置1640培养基的时候有没有加过Hepes啊?还是只加了2克NaHCO3啊?
  2 你说用HCl调节PH后,要用快点,你一般多长时间用完啊?因为我只培养一株细胞,所以1升的培养基应该能用好长时间.