[求助]细胞冻存中的技术细节问题?

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• leifengta (2012-7-21 11:48:38)

  
  离心后加培养液和冻存液,是直接在离心管里操作,还是要把离心后的细胞转出来到某个容器后再操作?

• guagua (2012-7-21 11:48:57)

  冻存的血清浓度是不是有点低？20％？
  一瓶细胞大概有多少细胞应该是知道的，如果你一瓶冻存一管的话，建议先加0.5ml重悬细胞，计一下数，再补足体积就可以。
  细胞种类不同，大小也是不一样的，实验初期还是需要计数的。

• yhz1973 (2012-7-21 11:49:16)

  
  DMSO是后加的吗？我从来没有听说这样做的。我们都是把freezing medium直接配好，然后再用来resuspend cell pellets，然后转入cryotube，再冻存。
  
  FBS的浓度根据细胞不同而不同，我们用的细胞系10%就够了。

• bling (2012-7-21 11:49:38)

  离心是不是久了点？我一般都不离心，直接消化完了就用血清吹打下来，不过血清的量很少，大概才18滴的样子，细胞吹打下来以后，按血清：DMSO=1:9的比例加入DMSO，混匀即可放4度冰箱了，效果也很好啊，我一般2瓶50ml的培养瓶的细胞，冻存一管

• leifengta (2012-7-21 11:49:58)

  
  谢谢各位的指点，我现在也有些明白了，是不是在冻存中血清的浓度还是比较重要的，一般都要求比培养时高的血清浓度？还有就是到底需不需要离心？各位多多发表自己的意见啊！我的实验室里没有－８０度的冰箱，我的计划步骤是４度３０分钟，－２０度一小时，然后悬于液氮瓶口两小时，最后沉入液氮，这样的过程可行吗？

• utt0989 (2012-7-21 11:50:17)

  
  离心后我们是直接在离心管里操作的. 在调细胞浓度时你应该知道细胞总量的，再根据你所需要的浓度加DMEM咯.
  一般都不直接加DMSO，因为这样对细胞损伤更大.
  先配制双倍的冻存液(6DMEM+2FBS+2DMSO)，用含血清的DMEM重悬细胞后，再缓慢加入等量的双倍冻存液，混匀立即放入4度冰箱.双倍冻存液可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤，缓慢逐滴加入是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。 血清10%～90%都可以，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。

• leifengta (2012-7-21 11:50:42)

  
  我的细胞的培养液是用的1640加胎牛血清,请问这样的培养液加DMSO可以配成冻存液吗?怎么配?

• okhaha (2012-7-21 11:50:59)

  一般冻存细胞的冻存液按照6：3：1的比例配制，即0.6ml的完全培养基，0.3ml的小牛或者胎牛血清，0.1ml的DMSO

• wanglaoshi (2012-7-21 11:51:17)

  
  每个实验室冻存细胞的方法都不一样.冻存液的配制也不一样,只要细胞冻存后复苏效果很好就行.冻存液中小牛血清的浓度从10%到90%都行,dmso的浓度在5%--10%之间.dmso可以最后加入的.没有-80度冰箱就用塑料瓶先吊在液氮罐口,4小时后放如液氮中.我这样冻存的细胞两年后复苏效果还很好.细胞量也不是绝对的,通常75厘米的细胞瓶细胞长到70%就能冻关键是冻存时细胞处在对数生长期,状态要好.

• leifengta (2012-7-21 11:51:35)

  
  谢谢各位战友.我已经试了一次,效果还可以