样品分离与蛋白质显色技术

　　二维聚丙烯酰胺凝胶(2DPAGE))电泳仍然是分离大量蛋白质最有效的方法, 但是, 对于质谱分析而言，2DPAGE并非总是需要的，尤其是对于某些膜蛋白、具有较高PI值的蛋白和溶解度较差不能进入2DPAGE第一相的蛋白质。实际上, 根据MS鉴定混合蛋白质的能力，以我们的经验在许多情况下用1D SDS-PAGE胶就能够满足要求，有时对于复杂蛋白质样品如细胞器蛋白质组的鉴定甚至是非常有利的。例如,我们用1DSDS-PAGE分离了用表面活性剂提取的小鼠肝脏中高尔基体制备物，然后鉴定了80多个蛋白质。某些情况下,尤其当用LC-MS/MS时，可直接分析复杂混合物而不用预先用胶进行分离.

　　传统上,1D或2DPAGE胶上蛋白质用35S 放射性标记显色或用考马斯亮蓝或银染，最近高灵敏度荧光染色已经得到应用。这些方法中有一些不适于质谱进行蛋白质鉴定，为了适用质谱鉴定，银染技术必须被改进以去除交联剂。下面我们将讨论适用于质谱技术的染色方案。另外为了避免污染物的引入，在实验中必需选用优质的试剂，同时操作时必需带手套，塑料器皿应该一次性使用或至少要清洗和专用。

　　下述方法中胶体考马斯亮蓝染色快速，价廉,几乎能够达到银染的灵敏度。首先，在2%醋酸/40%乙醇(V/V)中固定胶1小时，在此过程中一定要注意避免污染胶的表面，接着用5倍的水稀释胶体考马斯亮篮浓缩液，混匀配成50ul的溶液，取出10ml溶液，再加入10ml甲醇替换之。染色至少1小时后可得到初步的结果，而过夜染色可得到更理想的结果。染色后的胶用5%醋酸/25%乙醇溶液简单地冲洗，然后在25%甲醇溶液中脱色不超过1小时，最后把胶置于水中，在4 ℃下胶至少可保存几天以备下一步的质谱分析。我们还发现用商业胶染色仪器(Genomic Solutions Ltd.,St.Neots,UK)时能得到低背景的结果，尤其是当大量胶需要染色时。

　　我们所用的银染方案是根据Shevchenko等人改良的方法。首先，在50%乙醇/5%醋酸溶液中固定胶1小时，然后再用50%甲醇过夜浸泡洗胶，用水洗胶3×10min去除残余酸，并在0.02%(w/v)的硫代硫酸钠中浸泡2×15min.增敏，之后用冷水洗3×10min。然后室温下浸没在1%的冷硝酸银溶液中1-1.5h，除去硝酸银后用水洗2×1min。在含0.04%甲醛的2%碳酸钠液中展开，当溶液变黄以后除去展开剂，并用新鲜的溶液代替，让胶继续展开，最后去除展开剂并用5%醋酸洗胶，保存胶于1%醋酸溶液中。