[求助]有谁养过淋巴细胞,具体步骤和经验?

字体: 小中大 | 打印发表于: 2012-7-21 16:46 作者: 3648755 来源: 分析测试百科网

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[求助]有谁养过淋巴细胞,具体步骤和经验?

本人最近需要养淋巴细胞以备后续免疫诱导和抑制实验,由于本人之前从未养过细胞,对此一片空白,在此向各位大哥大姐求助淋巴细胞的培养步骤和经验,谢谢!

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is2011 (2012-7-21 16:47:58)

T 淋巴细胞的分离及体外培养
对各组大鼠无菌操作行肠系膜下静脉穿刺采血10ml,分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使形成层次分明的界面。
2200rpm离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85%的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。室温1800rpm离心10分钟，去除上清。
继续用PBS稀释液先后洗涤2次，每次1600rpm离心15分钟；
去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将沉淀调至1ml并轻轻吹打混匀，置37℃，5%CO2 温箱孵育1小时；
将细胞悬液进一步用无菌尼龙棉柱37℃，5%CO2 温箱培养1小时，分离出T细胞，台盼兰染色试验活细胞〉90%；
用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整T细胞浓度为2*106/ml,接种于24孔培养板内，每孔各1ml,于5%CO2、37℃培养箱内培养。
3648755 (2012-7-21 16:51:15)

感谢楼上的指导,以上步骤中的无菌尼龙棉柱是起什么作用,可以用其他方汉替代吗?另外如何检测分离出的细胞是T淋巴细胞,要作流式检测吗?以你的
66小飞侠 (2012-7-21 16:52:03)

无菌尼龙棉柱能将T，B细胞分离，B细胞会粘附到尼龙棉上，而T细胞不会。
ivyhwh ，我想问一下，无菌尼龙棉柱是你自己做的吗，如何做，还是买的，在哪买的，价格如何？谢谢
wsll (2012-7-21 16:55:01)

我们是把尼龙毛塞到注射器的针管里制成尼龙柱。尼龙毛要塞得均匀，不能太紧。然后消毒。注意冲洗细胞时用温热的培养基。
3648755 (2012-7-21 16:56:33)

感谢楼上各位战友的指导,小弟尚有一个疑问:许多人用的是96孔的培养板,可以用培养瓶养淋巴细胞不?另外如果长期培养,中间的换培养液如何进行?
请各位战友指导一下!谢谢!
greenbee (2012-7-21 16:56:57)

可不可以把步骤讲的详细点，用几毫升的针管，我们是要分离B细胞，如何把它捏下来，且柱子如何消毒，谢谢
969 (2012-7-21 16:59:47)

一般用5ml或10ml针管。消毒就用普通的高压。
过柱得的是T细胞。若得B细胞，要用T细胞可与绵羊红细胞结合的特性。淋巴细胞浓度2000万每毫升，加等量5％（体积比）的绵羊红细胞，轻离心，室温一小时。轻轻悬起细胞，镜下可见玫瑰花环。用淋巴细胞分离液分离。B细胞在界面，T细胞沉底。
现在一般都用磁珠什么，成本高。

淋巴细胞长期培养，肯定要加因子的。再24孔或6孔板做，比较方便。
fei1226com (2012-7-21 17:00:06)

学习了,谢谢各位战友的指导!最近在等定的试剂了,准备开始试养了
3648755 (2012-7-21 17:00:23)

学习了,谢谢各位战友的指导!
最近在等定的试剂了,准备开始试养了.