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[求助]请教稳定筛选中GFP表达问题
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尊敬的学长：
小弟在用脂质体Lipofectamine 2000将包含报告基因EGFP的真核表达载体转染肿瘤细胞中碰到以下问题,恳请解答:
(1) 小弟用别人馈赠的真核表达载体(已在pIRES2-EGFP的IRES上游MCS中插入目的片段)转染时,在荧光显微镜下（４８８－５０７nm的蓝光）观察瞬时表达情况．转染方法完全按说明书进行，细胞状态较好，质粒ＤＮＡ用ＱＩＡＧＥＮ的试剂盒抽提并酶切鉴定，载体也测序确认，用不同的ＤＮＡ与脂质体比例，用不同批次抽提的质粒，分别在２４孔和６孔板中转染，经不同时段（１２，２４，７２，９６小时）观察，均很少见到荧光细胞，有表达的细胞亮度也不强．将转染后的细胞用已经确定（用未转染正常细胞，６００ug/ml，７－１０天死光）的Ｇ４１８浓度（７００ug/ml)筛选２周，有少量的细胞成活，形态也发生改变，再高出两个梯度（９００ug/ml)筛选，仍能成活，渐形成小的克隆，未见绿荧光。
请问：哪位学长用过pIRES2-EGFP，是否瞬时转染效率不高？是否出现这种可能，在插入目的片段后，仍有一定的瞬时转染效率，但ＥＧＦＰ表达受抑制，而目的片段仍能表达？如何解释本例中转染后呈绿荧光的细胞少，而稳定筛选能形成一些克隆？
（２）小弟对同一批细胞用另一个ＳhRNA的真核表达载体转染，目的片段位于ＧＦＰ的羧基端，按同样的方法，同样的比例转染，结果１２小时后观察，实验组＼阳性对照＼阴性对照组，均有大量细胞出现非常鲜亮的绿荧光，２４＼４８＼７２＼９６小时观察荧光仍强．
请问，如果对这些转后的细胞Ｇ４１８按上述浓度梯度筛选，那么最后成活的或形成的小的克隆的细胞是否一定也出现强荧光？有无可能新增殖的细胞尽管已有目的片段的稳定表达，但不出现荧光？
（３）ＧＦＰ－Ｎ，ＧＦＰ－Ｃ的真核表达载体究竟在目的片段的表达上有无差异？
[ 本帖最后由 misswu61 于 2012-7-22 13:11 编辑 ]
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最新回复
newway (2012-7-22 13:11:56)
我没用过这个载体，但我们用pcDNA3.1作稳定表达系的时候，质粒是需要线性化的。因为非线性化质粒的德政和效率是很低的，但对表达不影响。我想你是不是把质粒线性化试试。至于标签为什么表达量低就不清楚了。
misswu61 (2012-7-22 13:19:40)
另外一个问题就是IRESE序列的添加对荧光蛋白表达的影响。在这个载体中，目的基因和荧光蛋白的表达是两个相对独立的过程，因为IRES是一个单独的核糖体进入位点，它和目的基因的表达不完全耦联，用这个载体的目的是为了避免形成没有活性的融和蛋白，事实上是荧光蛋白的表达会比目的基因的表达低很多倍数的。ＧＦＰ－Ｎ，ＧＦＰ－Ｃ表达的蛋白是目的蛋白和荧光蛋白的融和蛋白，大多数时候目的蛋白的活性会受到影响，经常用来做蛋白的亚细胞定位而已。
对于第二个问题，你自己去查一下IRES序列的功能就可以回答了阿！
misswu61 (2012-7-22 13:20:11)
我没用过这个载体，但我们用pcDNA3.1作稳定表达系的时候，质粒是需要线性化的。因为非线性化质粒的德政和效率是很低的，但对表达不影响。我想你是不是把质粒线性化试试。至于标签为什么表达量低就不清楚了。
greenbee (2012-7-22 13:21:01)
对于第二个问题，你自己去查一下IRES序列的功能就可以回答了阿！
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线性化后，在高抗压力下，一般都能成功地整合入细胞。我们做10厘米的dish筛选时，差不多也能长到几十个克隆群。挑一块24孔板没问题。至于转染效率我们没具体测试。酶切为点，应选择避开，目的基因，启动字，增强子，标签等，在载体骨架上的一般没问题。线性化方法就使用单酶切阿：）
greenbee (2012-7-22 13:21:23)
补充一下，所挑选细胞克隆的成功整合率经western检测大概在20~40%左右，不是很高的。有很多假阳性的结果的。一般都是挑12~24个单克隆，可以确保有一个。
TNT (2012-7-22 13:22:11)
所谓线形化是指把质粒单酶切后回收再转染吗？酶切位点的选择有什么讲究？
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