[求助]关于MTT的几个问题

最新回复

• utt0989 (2012-7-22 14:13:04)

  
  你的药有颜色，肯定会对实验结果有影响。你的低浓度加药组OD值总高于对照组，就是这个原因，可以看MTT的测定原理方面的书明白其中的缘由，建议你的解决方法：
  （1）每个浓度的药在做MTT实验时分别设置一个药物空白，以抵消药物颜色对实验结果的影响，具体是空白孔在叫DMSO的同时加入相应浓度的药物震荡后用扣板子的方法，然后相减可以（是否表达清楚，有点罗嗦）。这种方法不太好排除人为的误差，不提倡用。
  （2）更换方法，可以采用集落方法也可以办到的，具体见相应的实验方法。

• toy (2012-7-22 14:13:22)

  
  我认为药物对实验结果有没有影响应该看一下本底的OD值，即药物加MTT的OD值，（药物在离心前加入，且也用倒扣法）如果此值与只有MTT和DMSO的值相差不太大，说明药物颜色影响不是很大。
  至于你所说的低剂量加药组高于对照组，我想问下那么你的高浓度加药组情况又如何呢？？如果高于对照组的话，那么很可能是你的细胞接种没有接均匀，否则如果真是由于药物颜色的话怎么会只影响低浓度而不影响高浓度。建议多重复几次试验看看！

• 101010 (2012-7-22 14:13:39)

  
  我想问个弱智的问题各位，请问，你们说的"倒扣板子"是怎么做的啊？

• tuomu45 (2012-7-22 14:14:03)

  
  我的高浓度组OD值低于对照组,但我想那是因为细胞抑制较明显的原因,而在低浓度组细胞抑制不十分明显(肉眼见).
  
  空白组加药作为本底的方法对我有些启发,但空白组中无细胞,而实验组中有细胞,细胞表面本身会吸附药物,所以二者情况还不一致,这样空白组加药能否真起到本底的作用呢?不过我会试一下的.
  
  我一直没做空白对照,请问一般是否只做一个空白对照孔,最后每个加药孔的OD值去减这个空白孔的OD值?如果由于药物有颜色需要每个药物浓度都加一个空白组加药(离心前加药),那是不是各不同浓度孔需要减掉相应空白孔OD值?
  
  另外,我还有个问题,是不是MTT一定要做不同药物作用时间呢?比如作用24hr, 48hr, 72hr这个样子? 只做一个时间行吗?
  
  附:倒扣板就是将板翻过来扣在纸上,使孔中的液体流掉.

• vera+ (2012-7-22 14:14:22)

  
  我刚开始做MTT时采用的是把MTT甩出来的方法，不过此办法确实容易把兰色沉淀给甩出来，后来采用真空抽吸机用针头吸出来，结果就好多了，在吸的过程中，每孔操作尽量一致，比如都贴壁吸尽量一致的时间等，我觉得实验过程中最重要的就是均衡，每孔操作尽量一致的话，误差也会少得多。
  孔中留下液体，就算你的药是无色的，也会影响DMSO溶解后的颜色，所以建议尽量将液体吸干净。在液体吸干净了以后，本人认为即使药是有颜色的影响也不会很大，不放心的话可以设药物空白孔看看。
  做MTT时，对照组OD值一般在0.6~0.9之间是比较理想的，太低或太高都会影响结果的准确性。低浓度组的OD值高于对照组，是不是跟你药物浓度太低有关？因为在药对细胞的影响很小时，OD值比对照组高或者相当就不足以为其了。
  MTT要不要做不同的时间点，我觉得是要根据你的实验目的来的，如果你要做时间依赖性的话，就可以设定不同的时间点。不过我做MTT选的就是72小时的点，这是最常见的时间。

• lixi559 (2012-7-22 14:14:39)

  
  不知你所用的药物是什么？ 如果它对细胞的增殖有抑制作用，那么低浓度的药物组，OD值肯定要比高浓度的药物组要高的。其实在加MTT前观察一下倒置显微镜，最终的OD值趋势是可以心中有数的。
  不只你的药物分了几个浓度，如果不同组的OD值总是随着剂量增加而减小，这种剂-效曲线应该是可信的。
  我在加DMSO之前，一般都是把板子稍倾斜，枪头贴壁将液体吸出，一般不会把紫色结晶吸出。你的液体是有颜色的，我想还是要吸的干净一些。

• utt0989 (2012-7-22 14:15:01)

  
  我所说的药物空白对照，是指所有的条件都与你的药物组一致，包括细胞浓度等，只是加药的 时间不一致，目的是为了排除药物颜色的干扰，结果相减，从原理角度分析是这样的。
  另外再告诉你一个办法，你们实验室如果有真空泵（用于细胞实验吸费液的那种）的话，可以在前面加个针头，很细的那种就可以即保证把染料等吸掉又可以不把细胞吸走，但是操作要仔细，并且速度也比较慢。但是很有效！

• tuomu45 (2012-7-22 14:15:21)

  这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶. 但又有新问题: 镜下看结果挺好的,但上机后结果又让人难以理解. 我加入DMSO振荡约后发现很多孔中紫色分布很不均匀,不知这样会不会影响酶标仪正确读数,不知酶标仪是检测一个孔中的一个固定点,还是多个点取平均值?
  
  还有一个问题想请教: 96孔板中的贴壁细胞密度是多大范围时,细胞数和OD值才正相关呢?因为我培养时间较长,阴性对照和低浓度药组细胞已长满了,甚至局部已摞着长了,这样是不是会影响准确性?若降低接种浓度,是不是可靠性又差?

• c86v (2012-7-22 14:15:41)

  
  一个使用的办法：用灭过菌的滤纸试试