[求助]为什么我的心肌细胞不贴壁

最新回复

• yueban-1147 (2012-7-22 14:45:39)

  
  第一 鼠少,应该至少10只鼠
  第二 离心最好不用1000转
  第三 细胞计数达105太少,应该密度尽量大106-107,因为你得到的细胞有很大一部分是纤维细胞,最好纯化两次

• hulu呼噜 (2012-7-22 18:52:16)

  
  谢谢你的回帖，我把离心速度改成800rpm试一下，纯化两次是不指差速两次，具体怎么做？？是第一次差速后紧接着换了培养瓶再差速一次吗？？请指教！！

• baidukk (2012-7-22 18:52:40)

  
  就直接把你得到的细胞放于培养板或瓶内,两个小时后取出上清,可以轻轻冲一下,将上清放入另一器皿中,两个小时后再将上清取出,就可以了,你取出之后可以看一下原来的器皿,底层铺满了伸展开的纤维细胞.

• hulu呼噜 (2012-7-22 18:52:57)

  
  感谢，我一般90分钟后差速，那时就有心肌细胞贴壁了，两个小时会不会时间长一点？你做时就用两小时吗

• 白白的 (2012-7-22 18:53:21)

  
  我不同意楼上的意见，因为我们实验室一直在养心肌细胞，离心就是1000rmp，差速就是一次70分钟，细胞就种105，细胞一直长的很好，贴壁很好，搏动也很好。
  据我们的经验分析原因如下：
  （1）胰酶消化不好：胰酶浓度过低，我们室用0.25%胰酶加0.02EDTA（抑制细胞聚集），如果胰酶浓度过低，很难将心肌细胞消化下来，消化下来的多是成纤维细胞。而且消化次数过多，我们室最多消化4次，消化次数过多，细胞会受到损伤，其状态不好，贴壁和搏动均受影响。
  （2)培养液：我们曾经遇到过由于培养液的问题导致细胞贴壁不好，在换液的时候有大量细胞脱落的情况，后更换培养液，用新配的培养液后就有所改善。为排除培养液的问题，你可以单独取培养液进行培养（不加细胞）24——48小时，如果培养液有混浊，内有杂质，就是培养液的问题。
  （3）细胞密度：3-5×105为宜，密度太低，细胞之间不能建立联系长不好，太高了也会造成没有空间生长，相互抑制。
  总之胰酶消化是关键，既要保证细胞能被消化下来，又要保证所消化下来细胞的活性。

• zzzz (2012-7-22 18:53:37)

  
  你是否用台酚蓝观察细胞存活率？培养基最好用含10％胎牛血清的DMEM.还有在温箱中要拧送瓶盖。我觉得胰蛋白酶浓度并不像楼上所说的过低，文献上报道0.08%都不少，建议可以同时使用胶原酶或者Dnase I。

• hulu呼噜 (2012-7-22 18:53:56)

  
  感谢各位，我的方法基本上都是沿袭我上届毕业师姐的，她做得很成功，只用0.1%胰酶加0.02EDTA，所以我也一直这么用，这两次我综合了各位的意见，我觉得我的细胞不贴壁的主要原因应该是细胞的活力问题，所以为了提高细胞活力，调整了一下方法：
  1. 消化的时候第一次十分钟（上清弃掉），第二次8min，以后三次7min，
  共 消化五次，因为我观察了一下，从第三次开始组织块就变疏松了，上
  清中的细胞就很多了，而且在镜下看到有的细胞的活力已不好，所以我
  把后来的消化时间就缩短了（以前都是8min） ；
  2. 每次的上清吸到离心管（加有10％FBS DMEM终止液，提前置于冰块中，
  保持四度）马上混匀离心，然后倒掉上清，再加入终止液吹打混匀，放
  入四度冰箱，等消化完毕后把所有管集中起来，再离心一次（以前是等分
  次消化结束之后一起离心两次）；
  3. 离心时改为800rpm，5min；
  4. 差速两次，每次90min，第一次贴壁的成纤维细胞很多，第二次只有零
  星的成纤维细胞贴壁，如果是这样我觉得好像只差速一次就可以了，不
  知道楼上第二次差速后是否也这样；
  这次做了六只乳鼠，细胞密度5×10的五次方，胎盼兰染色细胞的活力大约80％，我现在想到的可以提高细胞活力的方法就以上这几方面，希望各位再帮我提点意见，还有没有其他方法，可以在我现在方法的基础上再有所改进，我昨天刚按照以上方法做完，今天上午只看了一下差速前的瓶子，成纤维细胞贴得很多，因为听说48小时之内最好少动细胞，所以没看心肌细胞瓶，明天看了再把结果告诉大家！
  我们科里没有人亲自做过原代心肌细胞，唯一做过的师姐也毕业走了，所以我一直在自己摸，很郁闷！！希望在大家的帮助下我的细胞很快能跳起来！！！

• zzzz (2012-7-22 18:54:15)

  
  我对你改进方法中有点看法：“2. 每次的上清吸到离心管（加有10％FBS DMEM终止液，提前置于冰块中，保持四度）马上混匀离心，然后倒掉上清，再加入终止液吹打混匀，放入四度冰箱”，我觉得应该加含血清的培养基混匀，置室温，因为低温对心肌细胞是个不小的刺激，可能会影响细胞活性，甚至死亡增加！还有，差速贴壁一次足矣，但是要加BRDU！仅供参考

• hulu呼噜 (2012-7-22 18:54:32)

  
  我用改进的方法做，心肌细胞的活力还是不够，真是郁闷，我用的Gibico公司的进口分装的胰酶，不知是否是我胰酶有问题，大家都用的是那个公司的胰酶！